基于CRISPR捕获非编码RNA结合蛋白研究新突破

来源：核酸检测科学前沿

近日，NatureMethods杂志在线发表西北农林科技大学与香港城市大学的联合研究题为：“CRISPR-Assisted Detection of RNA-ProteinInteractions in Living Cells” 该论文成功开发了一种检测活细胞内RNA与蛋白质相互作用的新方法：CARPID。

长链非编码RNA？

长链非编码RNA（Long non-coding RNA, lncRNA）是一类本身不编码蛋白、转录本长度超过200nt的长链非编码RNA分子，它可在多层面上（表观遗传调控、转录调控以及转录后调控等）调控基因的表达。

lncRNA最初被认为是RNA聚合酶II转录的副产物，是一种“噪音”，不具有生物学功能。然而，今年来的研究表面，lncRNA参与了X染色体沉默、染色体修饰和基因组修饰、转录激活、转录干扰、核内运输等过程，其调控作用正在被越来越多的人研究。

CARPID技术

要研究lncRNA在一些重要生理活动以及人类疾病发生过程中的机理，那么了解这些lncRNA的结合蛋白究竟是什么，这是其中的重要一步。

CARPID利用CRISPR/CasRx系统，将与之融合的BASU生物素转移酶特异牵引至活细胞中目标lncRNA附近，对邻近蛋白进行生物素化标记，以方便使用链霉素亲和偶联磁珠分离，然后对分离的蛋白质进行质谱的无标记定量对比分析，确认目标lncRNA的结合蛋白。

图1. CARPID识别活细胞中lncRNA-XIST相关蛋白

相较于以往的方法，CARPID的优势在于它不需要经过预先的小分子或者高能紫外线的交联，而是在生理条件下检测活细胞的lncRNA与蛋白质相互作用，可以有效避免交联所产生的系统性误差，例如一些非特异性结合的蛋白质可能会因为交联而被误判为某种lncRNA的结合蛋白质等。此外，由于其他方法几乎都需要设计多个RNA探针来富集目标lncRNA，对于细胞中含量比较低或者长度比较短的lncRNA技术难度较大。

而CARPID，仅仅需要30-80个核苷酸的识别区，且BASU可以在同一个蛋白质的多个位点上标记生物素，大大提高了方法的敏感性。

图2. CARPID识别活细胞中lncRNA-DANCR和MALAT1相关蛋白

将CARPID方法应用于已被广泛研究的长非编码RNA XIST上，团队发现了很多之前未报道的XIST相互作用蛋白，包括转录起始因子TFIID亚基TAF15和ISWI染色质重塑因子SNF2L。随后的生化和功能验证确认了相互作用，并提出了X染色体失活调控的新机制。

通过CARPID技术检测活检组织的长非编码RNA含量，如lncHIFCAR在口腔癌患者的肿瘤细胞中高表达，可作为临床上该疾病的检测标志物和治疗靶点；长非编码RNA LIPCAR在发生左心室重塑的患者中特异性表达，因而可作为心脏重塑的分子检测标志物；在胃癌患者中，长非编码RNA AA174084处于下调状态，因而可成为胃癌早期诊断的标志物；在结直肠癌患者体内，若lncRNA CCAT1和CCAT2高表达，则意味着该疾病生存率低和复发率高，所以也可作为临床检测标记物。

此外，在外泌体中也存在长非编码RNA，在肿瘤细胞中，外泌体长非编码RNA表达量升高，会促进肿瘤的发生，因此或可直接检测血液中某些长非编码RNA来作为临床检测标记物。

在活细胞内精准鉴定lncRNA的相互作用蛋白，可以帮助我们更好地揭示某些复杂人类疾病，如肿瘤、阿尔兹海默症、银屑病、脊髓小脑共济失调 8 型 (SCA8)等众多疾病的分子机制。