关于利用拉曼成像对细胞进行快速定位的研究

来源：两江科技评论

导读

7月10日，东京大学化学系Keisuke Goda（合田圭介）课题组通过超快多色受激拉曼散射（ultrafast multicolor stimulated Raman scattering, SRS）显微镜直接探测细胞内特殊分子振动来实现实时单个活细胞分类，速度可高达约100个细胞/秒，且无需荧光标记。该成果以" Raman image-activated cell sorting "为题发表在Nature 子刊 Nature Communications 。

该技术有望填补许多先前基于荧光技术难以实现的空白：如造血干细胞移植；分离卵巢癌干细胞；长时间内对细胞内代谢物（如蛋白激酶C、泛素）进行脉冲追踪分析以及其他无标记条件下的细胞周期分析、合成细胞分类、和细菌细胞分类等。

背景介绍

细胞是生物体基本的结构和功能单位，了解细胞间巨大的差异性有助于我们对生物系统的认识和开发。随着基于图像的细胞选择的出现，利用蛋白质定位、受体聚集、核形状、细胞骨架结构，以及细胞的生理功能（如增殖、代谢、分泌、分化、信号传导、转移和免疫突触形成）来识别细胞内分子空间结构，从而从大量异质群体中物理分离目标细胞的技术逐渐成为了可能。

目前的识别技术主要依靠荧光标记来进行细胞表型分析，这是一种间接测量细胞中分子的方法。主要有以下局限性：最重要的是其不可用于活细胞，这就制约荧光标记法的大部分应用。其次，并非所有类型的细胞和蛋白质都能实现的可被染色。最后，荧光探针通常体积庞大，经常干扰包括代谢物在内的小生物分子的功能。

为了克服这一重要难题，Keisuke Goda课题组研发了一套无需染色便可快速地获取并处理拉曼图像以对细胞进行分类的系统：拉曼图像激活细胞分拣机 (Raman image activated cell sorter, RIACS)（图1）。

图1：RIACS系统

Nat Commun 11, 3452 (2020)（Fig.1）

这套系统是通过相干拉曼散射显微术来直接测量特定的细胞内分子振动，并将拉曼图像采集、数字图像处理与流体和机械设备无缝集成到一个完整的系统中（图1），实现了足够快速地获取并处理拉曼图像以对细胞进行分类的能力（100个细胞/秒）。

Frits Zernike于1930年代发明的相差显微术，考虑在透明样本的折射率分布会改变透射光波前的相位分布问题。当通过样品的透射光与另一束参考光干涉时，相位的差异可以转化为振幅的变化，得到的图像就能反映透明样本的结构信息。这种方法避免了细胞染色过程中许多破坏性步骤，可用于无损地观察活细胞的动态过程。相差显微术的发明是相干拉曼散射显微术的重大突破，Frits Zernike也因此获得1953年的诺贝尔物理学奖。

相干拉曼散射显微术是通过探测目标分子特定的振动来成像，通过非线性光学过程来提高了检测的灵敏度，同时本征地具备三维成像能力。其可以对脂类等不易被标记的物质成像，还可以对生物体内特定小分子物质如药物等，以及生物大分子如核酸、蛋白质等进行无需标记的成像，因此成为极有潜力的活体成像手段。

创新研究

传统的细胞分选成像技术虽然已经成功实现对循环肿瘤细胞进行全基因组测序等重要应用，但是其需要依靠荧光标记来进行细胞表型分析，这是一种间接测量的方法，并且需要在图像的复杂性（与精度相关）以及图像处理速度（与响应时间相关）之间平衡。

简单来讲，传统的细胞分选成像技术需要先给目标物染色后，再挑选，并且挑选速度极慢。

文中，作者通过超快多色受激拉曼散射显微镜直接探测细胞内特殊的分子振动来展示拉曼图像激活的细胞分类。具体而言，该技术实现了基于SRS图像的实时单个活细胞分类，吞吐量高达约100个细胞/秒，且分类准确（图2）。

应用与展望

为了展示拉曼图像激活细胞分选技术的广泛实用性和适用性，作者评估了其在不同细胞类型和大小下的成像能力，如图3。该图显示了RIACS根据细胞内分子的SRS光谱获得的各种微藻和哺乳动物细胞的分类图像，其中包括了细胞直径为3到20µm的微藻细胞，同种细胞不同培养基中生长的细微差异以及7天内不断积累的脂肪细胞的实时数据等，充分展实了该分选技术的强大准确以及普适性。

图3：RIAC成像的各种类型的细胞

Nat Commun 11, 3452 (2020)（Fig.3）

另外，拉曼图像激活细胞分选机可以在无标记条件下的细胞周期分析、合成细胞分类和细菌细胞分类中发挥重要作用，虽然需要进一步的实验证据来验证这些应用的必要性，但对于分子振动图像对比度的高含量细胞分选，可以广泛应用期望值很高。

同时，Keisuke Goda课题组的目标是要将过往传统的一维流式细胞仪扩展到二维，这将会有助于解决新的基础生物学问题，例如可以寻找一些影响细胞内各种不同的分子在空间定位的基因并研究其功能、研究细胞空间结构与生理功能之间的关系等。