植物液泡膜定位的Ca2+泵调节免疫过程中Ca2+信号学术资讯

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潜伏的病原体在环境中无处不在，但植物已经进化出感知系统来识别它们的存在并触发适当的防御反应。这些传感网络的最大特点之一是通过质膜定位的模式识别受体(PRRs)，这些PRRs能够结合病原体相关分子模式(PAMPs)：即病原体存在的保守分子信号。当PAMP与PRRs结合时，PRRs触发一种称为模式触发免疫(PTI)的免疫反应。
细胞内Ca2+的变化被认为是细胞信号网络中无处不在的元素，因此Ca2+信号与植物免疫反应的触发也是密切相关。大量的观察表明细菌激发子肽flg22触发Ca2+瞬变，但在防御反应网络的触发过程中，关于Ca2+转运体的研究仍然有限，这些转运体参与了细胞Ca2+动力学的形成。然而，自抑性Ca2+-ATP酶(ACA)泵的作用是将Ca2+从胞浆中排出，与这些事件有关。
近日，PNAS杂志在线发表了美国威斯康星大学麦迪逊分校Simon Gilroy教授题为“Tonoplast-localized Ca2+ pumps regulate Ca2+ signals during pattern-triggered immunity in Arabidopsis thaliana”的研究论文。探索了两个液泡膜定位泵ACA4和ACA11是如何影响flg22依赖的钙信号和相关的防御反应的。
作者检测了基于荧光蛋白的钙离子传感器YC-Nano65的aca4/11植物的细胞质钙动态。随着Ca2+水平的增加，YC-Nano65的青色荧光蛋白(CFP)信号减弱，而传感器中的黄色荧光蛋白(YFP)配对的FRET信号增强。因此，FRET/CFP比值(ΔR)的增加反映了细胞内钙离子([Ca2+]Cyt)的增加。Aca4/11突变体在花序抽薹前后自发形成损伤，作者只对尚未形成损伤的植物进行成像，观察到基线[Ca2+]Cytin aca4/11显著升高。

作者也检测了10天龄幼苗的完整和分离的子叶的[Ca2+]细胞值。在aca4/11背景下作者检测Ca2+对PAMP flg22的信号响应。发现与COL-0相比，flg22诱导了ACA4/11莲座叶和子叶中更大的Ca2+增加。表明在与PAMP感知相关的信号过程中，液泡膜定位的ACAs对于Ca2+从细胞质中正确流出是重要的。表明根尖ACA4和ACA11功能的丧失对细胞Ca2+稳态的影响可能比这些植物的地上部小。aca4/11防御信号表型在芽组织中表现突出，作者决定将后续的分析集中在植物的这些地上部分，使用子叶作为测定Ca2+反应的主要器官。整体器官成像不能分辨单个细胞，因此作者使用共焦比成像来跟踪加入flg22后单细胞分辨率的变化。结果与aca4/11损伤导致所有细胞内Ca2+反应普遍升高的效应一致。结果如下图所示。

许多病损模拟突变体在高温中生长时表现出病损抑制，这可能是由于植物激素水杨酸的生物合成减少所致。虽然在22°C生长的aca4/11植株表现出矮化并最终形成损伤，但在28°C下的生长抑制了这两种aca4/11表型，这种影响随着植株生长的更大莲座丛而变得更加明显。作者还使用flg22反应的分子标记来表征aca4/11如何影响防御途径的诱导。与野生型Col-0植物相比，在aca4/11背景下，30分钟依赖flg22的FRK1、PHI1和ICS1转录本的增加没有改变。然而，在aca4/11植物中，防御调节子CBP60g的诱导和对PST细菌攻击(被视为细菌可提取菌落形成单位的减少)的抗性都有所提高，其中抗性表型在接种后1d(1DPI)的初始入侵时最为明显。28°C下的aca4/11响应程度与COL-0在此温度下的响应程度非常接近。有趣的是，在22°C和28°C下，aca4/11的FRET：CFP值仍然显著高于Col-0，而Col-0基线在28°C高于22°C。植物对flg22的敏感性是通过改变fls2水平而改变的，而不是更直接地影响Ca2+稳态和信号相关的机制。结果如下图所示。

作者通过将非液泡膜ACA靶向aca4/11双敲除的液泡膜来鉴定恢复双敲除表型的能力。选择将质膜泵ACA8重新定位到液泡膜上，创建了一种在核心泵区(ACA8-D482A)的P-环中具有点突变的ACA8-11C嵌合泵，对于ACA8-11C及其D482A变体，生成了在C端用mGFP5标记，带有标记的ACA8-11C，用于Ca2+成像实验，所有泵变异体均由组成型AtUBQ10启动子驱动。结果表明ACA8-11C-mGFP5，而不是D482A-mGFP5，能够恢复aca4/11的生长和病变表型。表明ACA8必须保留功能泵能力才能挽救双基因敲除表型。重要的是，ACA8在质膜上的天然位置的过度表达并没有挽救aca4/11背景中的这些表型，这表明恢复需要特异性地在液泡膜上的Ca2+外流活性。随着flg22诱导的细胞内[Ca2+]峰值的恢复，flg22细胞内的Ca2+响应随时间的变化而变化，表明Col-0和aca4/11都能在相似的时间点恢复基础Ca2+水平，这表明重新定位的泵也恢复了aca4/11的Ca2+表型。此外，ACA8-11C-FLAG在aca4/11背景中的表达恢复了较长期的恢复动力学，类似于野生型。结果如下图。

该研究发现，将通常在质膜上发现的Ca2+泵重新定位到液泡膜上，可以恢复液泡膜泵基因敲除突变体的免疫相关表型和异常的Ca2+信号动力学。即液泡膜定位的泵对于正确维持先天性免疫反应中的钙动态至关重要，但内源性液泡膜泵特有的任何调节系统可能不需要支持这些信号过程。

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