利用细胞成像技术进行多角度癌症研究

来源：BioArt

2019年，澳门科技大学中药质量研究国家重点实验室的刘良教授团队在Scientific Reports上发表文章：Neferine induces autophagy-dependent cell death in apoptosis-resistant cancers via ryanodine receptor and Ca2+-dependent mechanism，揭示了Neferine通过Ryanodine受体（RyRs）作用可以诱导“抗药性”癌细胞死亡，并且发现这种钙离子依赖性通路的作用机制。

研究团队通过在DLD-1 Bax-Bak结肠癌细胞系（已知具有多重耐药性的癌细胞系）中分别加入DMSO（Ctrl）、Neferine、钙离子螯合剂（BAPTA/AM，BM）或RyRs抑制剂（Ryr），利用DeltaVision显微镜宽场还原型反卷积的技术对所有实验组和对照组进行成像，再分别统计视野中细胞自噬标志物LC3 II颗粒的数量。结果显示Neferine可以使DLD-1 Bax-Bak结肠癌细胞系发生自噬，而这种现象在加入BM和Ryr之后就消失了，指示Neferine通过激活RyRs诱导抗凋亡癌细胞系发生自噬现象。

（左图，红色标记自噬标志物LC3 II；右图，统计不同条件下LC3 II颗粒占比）

在Hela细胞系中，研究团队通过分别加入DMSO（Ctrl）、Neferine、AMPK抑制剂（CC）、CaMKKβ抑制剂（STO-609）或钙离子螯合剂（BM），孵育4h后，再结合DeltaVision显微镜宽场还原型反卷积进行荧光成像和细胞计数。根据统计结果显示当Neferine组各自加入CC、STO-609、BM时，LC3颗粒的数量明显下降，指示CaMKKβ-AMPK-mTOR信号转导级联反应在Neferine介导的细胞自噬下起着重要的作用。

（左图，统计不同条件下GFP-LC3颗粒占比；右图，绿色指示自噬标志物LC3颗粒）

作者利用显微镜（DeltaVision宽场还原型反卷积）等技术，证明了莲花提取物——Neferine对抗药性癌细胞系诱导自噬的作用，为该化合物未来可作为治疗抗药性癌细胞提供可能性。

核糖体是由蛋白和核酸共同组成的复杂生物结构，负责活细胞中蛋白质的合成。在癌细胞恶性增殖需要大量蛋白质的条件下，核糖体数量增多，起到了至关重要的作用。通过抑制核糖体的生物发生，已经成为了近些年研究癌症治疗的新方法。

核仁是哺乳动物核糖体生物发生早期阶段的场所。核糖体的组装从三个rRNA分子形成RNA前体开始。rRNA基因被长的基因间隔区隔开，排列形成特定的染色体区域——核仁组织区，重复单元的转录活性和染色质状态取决于细胞的生理状态。在前期研究中，科学家们利用电镜成像，已经揭示了在核仁区域核糖体生物发生过程的各个阶段，但是活性rDNA染色质重复单元之间的空间位置和结构依然没有得到很好的解决。

近日，Scientific Reports在线发表了德国慕尼黑大学Heinrich Leonhardt教授团队的成果：Super-resolution in situ analysis of active ribosomal DNA chromatin organization in the nucleolus。该研究利用DeltaVision OMX 3D-SIM超高分辨率技术揭示了核仁中活性rDNA染色质的结构，为癌症治疗的靶向位点提供了新的方向。

研究团队在IMR90（人胚肺成纤维细胞）和MEF（小鼠胚胎成纤维细胞）细胞中分别标记了UBF（Upstream Binding Transcription Factor，上游结合转录因子，编码活性rDNA）和NPM1（nucleophosmin，核基质蛋白）。3D-SIM成像下，图像从空间上揭示在MEF细胞中，具有转录功能的rRNA基因位于NPM1之中。

（蓝色指示DNA，红色指示UBF，绿色指示NPM1。3D-SIM结果显示强的UBF信号基本被限制在NPM1之中）

接下来，在GFP-Fibrillarin（核仁纤维蛋白）转染的MEF细胞中进行UBF/Fibrillarin/NPM1三通道成像，3D-SIM结果清晰显示，在核仁区域内，早期核糖体加工因子Fibrillarin与UBF几乎是分离状态。

（蓝色指示NPM1，红色指示UBF，绿色指示Fibrillarin。3D-SIM结果显示三种物质的空间位置关系）

利用FISH技术，在IMR90细胞中标记UBF和rDNA IGS（intergenic space，间隔区）进行3D-SIM成像，图像显示编码的rDNA区域和IGS完全分离。

（蓝色指示DNA，红色指示UBF，绿色指示rDNA IGS。3D-SIM结果显示UBF与rDNA IGS的空间位置关系）

超高分辨率成像技术的不断发展提高了我们对单细胞水平上细胞过程的了解，它弥补了电镜下，核仁组织被破坏的缺点，维持组织活性的情况下揭示了核仁中活性rDNA染色质单位及其3D组织的关键特征。

肿瘤的多种治疗方法，包括外科手术、放射疗法或者化学疗法等等，已经有了相当大的进步。尽管医疗水平如此发达，高度浸润性癌症由于其具有高度扩散性、高度浸润周围组织等特点，给现有的医疗手段带来了巨大的挑战，是生存率极低的一种恶性肿瘤。高通量筛选（High-throughput screening，HTS）技术以其高效性，已经成为针对肿瘤特异性药物开发的公认方法。但是直到现在，仍然还缺少针对高迁移性癌细胞的HTS模型。