小分子，大作为：邓宏魁/卢实春/袁正宏合作团队突破人肝细胞体外长期培养瓶颈

来源：BioArt

原标题：专家点评Science | 小分子，大作为：邓宏魁/卢实春/袁正宏合作团队突破人肝细胞体外长期培养瓶颈

编者按：

由于缺乏适当的培养条件与微环境，体外源于干细胞诱导分化所获得的功能细胞，很难真正成熟并长期维持其功能，是再生医学研究和应用中长期面临的挑战。在过去的几十年里，人们尝试了改变培养材料，共培养以及三维培养等很多方法，但始终未能建立一个简单高效，稳定的功能细胞体外培养体系。为解决这一问题，邓宏魁研究组等以体外培养过程中快速失去功能的人原代肝细胞为研究对象，筛选到5种化学小分子的组合并利用它们在体外成功实现了肝细胞功能的长期维持。在长达一个月以上的培养过程中，5C组合抑制了肝细胞的去分化，细胞整体基因表达谱与体内的肝细胞高度相似，并长期维持了白蛋白分泌、尿素合成、药物代谢等肝细胞的功能。相关工作于2019年4月26号在线发表于Science杂志上。鉴于该工作的突破性意义，BioArt特别邀请到了乙肝病毒专家、中国工程院院士闻玉梅教授以及从事肝脏疾病相关研究的孙序序研究员对上述工作进行了点评，以飨读者！

点评 | 闻玉梅（中国工程院院士）、孙序序（上海交通大学基础医学院）

撰文 | 珊今

责编 | 兮

据统计，全球遭受肝脏疾病困扰的人约有10亿，其中约4亿来自于中国【1】，因此寻找有效的肝病治疗方法对于全人类尤其是对于中国来说显得极为迫切。肝脏疾病的研究一直缺乏良好的体外模型，人肝原代细胞（Primary human hepatocytes , PHHs)本应该是理想的模型，但是其在体外培养条件下在很短时间内就会发生形态变化，丧失肝细胞功能进而发生衰老和死亡。体外长期培养人原代肝细胞并维持其成熟功能一直是领域里的瓶颈所在。

2017年，一些研究组利用去分化为肝前体细胞状态的方法在体外培养大鼠和小鼠肝细胞获得成功【2,3】，人们看到了实现人原代肝细胞体外培养的可能性。2018年11月，惠利健研究组与合作者在Cell Stem Cell上发表论文，该研究实现了人肝细胞的体外扩增，并证明了增殖的肝细胞体内功能与人原代肝细胞接近【4】。以上的研究都涉及到了细胞的去分化，因此是否存在更简单高效安全的方法实现人原代肝细胞长期培养并维持其成熟功能呢？

化学小分子诱导重编程从问世之初一直受到大家关注，相比于传统转基因方法介导的重编程，化学小分子不但可以避免内源基因修改带来的风险，它同时兼具了细胞膜穿透性、可逆性、可控性和易于制造等诸多优点。早在2013年，北京大学邓宏魁教授团队于在Science上发表文章，报道了他们建立了一套完整可靠的小分子重编程方法，首次利用小分子化合物将体细胞重编程为多潜能干细胞（chemically iPSC, CiPSC）【5】；此后该团队相继利用小分子诱导皮肤成纤维细胞为功能神经元细胞(CiN）【6】；建立了具备全能性功能特征的多潜能干细胞(EPS细胞)【7】。

2019年4月26日，邓宏魁教授与中国人民解放军总医院卢实春教授、复旦大学袁正宏教授在Science上发表了题为Long-term functional maintenance of primary human hepatocytes in vitro的研究成果，仅利用5种化学小分子就实现了体外肝细胞功能的长期维持。这些工作表明了化学小分子在精细调控细胞命运和功能上的优越性，这一方法也为其他类型细胞体外功能的长期维持提供了新的途径。

在这项研究中，研究者们首先比较了新鲜获得的人肝原代细胞以及在体外培养了24小时的细胞的转录谱差别，他们发现转化生长因子β（TGF-β）通路以及上皮间充质转换（EMT）诱导子的相关基因在培养24小时后的人肝原代细胞中发生了显著的变化，随后他们测试了这些通路相关的小分子抑制剂，并找出了五种关键的小分子抑制剂：FSK, SB43, DAPT, IWP2和LDN193189，被他们称作5C。

5C处理使人肝原代细胞得在体外长期培养下保持正常形态和增殖特性

后续的研究发现，5C处理使得人肝原代细胞在长期体外培养条件下保持了原有的正常形态，并且通过检测mRNA水平，发现5C处理后保持了肝细胞原有的基因表达模式。因为肝脏是重要的解毒以及代谢器官，研究者们还检测了用5C处理的肝原代细胞中CYP（Cytochrome P450）基因的表达及其酶活性，发现相较于新鲜提取的肝原代细胞均没有明显差别。值得一提的是，在长达一个月以上的培养过程中，5C组合抑制了肝细胞的去分化，细胞整体基因表达谱与体内的肝细胞高度相似，并长期维持了白蛋白分泌、尿素合成、药物代谢等肝细胞的功能。

那么这种5C处理的肝细胞有没有可能作为一种药物筛选平台呢？邓宏魁研究组与袁正宏研究组合作，基于5C培养条件，成功建立了乙型肝炎病毒感染模型：持续高水平表达乙肝表面抗原、e抗原、合成乙肝病毒DNA等感染指标，尤其是能够长期稳定产生乙肝病毒复制必需的cccDNA。这一模型的建立，对于乙肝病毒的深入研究与药物研发具有重要意义。

我国约有1.2亿人携带乙肝病毒,目前仍然没有有效的治愈方法。因为乙肝病毒侵入肝细胞后,形成了一种很难被清除的病毒复制模板cccDNA,目前还没有针对这个病毒复制关键靶点的药物。相形之下，丙型肝炎病毒的发现虽然晚于乙肝病毒，但基于有效的体外病毒感染模型，已成功筛选并获得治愈丙肝的药物。5C培养条件下的肝细胞支持乙肝病毒的高效感染，并能够长期产生cccDNA，可作为理想的药物筛选模型,为治愈乙型肝炎带来希望。

总之，这种仅用5种化学小分子处理来体外长期培养人肝原代细胞的方法易于实现，极适用于药物的高通量筛选，为肝脏疾病的治疗提供了更为简便的研究工具，具有重大的现实意义。

据悉，北京大学邓宏魁教授、解放军总医院卢实春教授以及复旦大学袁正宏教授为该论文的共同通讯作者，向晨罡博士、杜媛媛博士以及孟高帆博士为该论文的共同第一作者。