新兴纳米孔测序技术为转基因植物研究揭示了前所未有的细节

来源：BioArt

近期，美国加州索科尔研究所（Salk Institute）的研究人员使用最新的纳米孔DNA测序技术，在分子水平上对将新的基因插入植物基因组时的系列事件进行研究。索科尔研究所是美国生命科学领域成果最多、质量最高的研究机构之一。

研究人员绘制了具有最高分辨率的转基因植物系的基因组和表观基因组，以确切地揭示当插入一片外源DNA时，在分子水平上所发生一系列事件。他们的研究结果发表在了2019年1月18日的《PLOS遗传学》杂志上，研究阐明了用于植物编辑的常规方法，并提供了更有效地减少潜在脱靶效应的新方法。

不论是出于基础研究目的，还是为了增加粮食作物的健康或营养，当研究者想要将一种新的基因放入植物基因组中时，通常是依靠根癌农杆菌（Agrobacteriumtumefaciens）来完成。土壤杆菌是引起冠瘿肿瘤的细菌，常在树干上生成大的凸起。在几十年前，科学家们发现当细菌感染树木时，它会将一些DNA转移到树的基因组中。自那以后，研究人员便采用了土壤杆菌的这种转移能力，根据自己的研究目的，利用它转移DNA（T-DNA）的能力来将所需的基因转移到植物中。

最近的DNA测序技术提示，当使用农杆菌T-DNA将新基因插入植物中时，它可能导致天然DNA的结构和化学性质发生额外变化。

文章的共同第一作者Florian Jupe研究员表示，“这其中最大的不确定因素在于T-DNA是否插入了基因组、并同时插入了你所想要的T-DNA拷贝数。”

由于T-DNA方法可以将所需基因的许多拷贝整合到植物中，因此难以使用传统的标准DNA测序方法来对基因转移的最终结果进行研究，这是由于大多数技术难以对高度重复的DNA序列进行测序。由此，研究小组转向了一种新型的方法组合，通过结合纳米孔长读长测序（nanopore sequencing）和光学图谱（optical mapping），在高分辨率的水平上对这些重复的长复杂片段进行观察。

纳米孔测序技术是由英国Oxford Nanopore Technologies公司研发的新一代单分子长读长测序技术。其独特优势在于，它是一种基于电信号的测序技术，无需通过检测光或者荧光信号来实现碱基序列的读取。可以实现对原始DNA或RNA模板进行直接、准确的测序。

在纳米孔测序中，蛋白质纳米孔被嵌入在合成膜上，在膜上形成通道，并浸没在电生理溶液中，使离子电流通过纳米孔。待测分子接近或通过纳米孔时，会引起电流信号发生特征性改变。原始电信号被用来进行实时分析，用来确定正在通过该孔的DNA或RNA链的碱基序列。由于纳米孔技术支持对分子进行直接测序，无需PRC扩增，从而能够消除扩增带来的偏好性。在纳米孔测序中，读长长度与制备样本中DNA或RNA的长度一致。研究者可以根据实验设计选择恰当的样品制备方案，自行决定读长的长度。目前已能够获得数万到数十万碱基的读长，当前记录最长读长超过2Mb。

在具有大型结构变异和高水平重复区域的基因组中，长读长能够提供高质量、更完整、更连续的基因组组装。并且能够简化组装，如果把这比喻为拼拼图，读长序列越长，组装越容易。对于DNA来说，它的优势在于能够简化从头组装，改进参考基因组，进行phasing，以及快速的宏基因组物种鉴定。对于RNA，它能够用于表征全长转录本，以及对异构体、剪接变体和融合转录本进行量化和分析。

研究人员将纳米孔测序和光学图谱结合，将其应用于植物生物学中常用的模型植物——拟南芥（Arabidopsis thaliana），并随机选择了四个T-DNA系。这些植物来自于大量T-DNA插入的突变体，这些突变体是通过一种名为浸花法（floral tip）的拟南芥转化方法而获得，用于对基因功能进行研究。

利用光学图谱分析T-DNA插入的大小和结构，结果显示，这些植物在其基因组中具有一到七个不同的插入或重排，大小相差几乎为十倍。在MinION测序仪上对两个品系进行纳米孔测序（nanopore sequencing），并利用纳米孔长读长数据进行基因组重建后，研究人员获得了高度连续的基因组组装，在单碱基水平的分辨率上证实了片段插入。其中包括在一个所选品系中，染色体之间发生交换或易位的整个DNA区段。基因插入本身显示出了多种形态，插入的DNA片段有时会被打乱，会发生倒置甚至沉默。

“这项研究甚至在一年前都还不可能实现，” 文章的另一位联合一作，来自J. CraigVenter研究所的Todd Michael表示，“Nanopore测序，有些人将它称为DNA测序的“圣杯”，它彻底改变了对基因组甚至是最复杂的区域的解读，这些区域到此前为止是完全无从接近和未知的。”

在研究小组研究名为组蛋白的遗传物质时，他们还发现了一些其他变化。组蛋白将DNA包装到结构单元中，这些组蛋白的修饰介导一种基因是否可以被细胞使用，这种水平上的调节被称为表观遗传学。根据T-DNA整合的位置，某些附近组蛋白修饰的发生或消失可能会改变其他附近基因的调节或激活。

研究人员表示，在理想情况下，T-DNA会将所需基因单一的、功能性拷贝插入到植物中，并且对植物基因组无近期副作用。尽管他们的研究结果表明，在拟南芥中这种情况并不常见，但他们的方法为更好地理解和监测这些影响提供了可能的途径。

“现在，我们有了第一个对T-DNA插入如何塑造局部表观基因组环境的高分辨率洞察。”

“这项技术非常令人兴奋，因为它可以让我们获得对这些转基因拟南芥更清晰地认识。”

Salk研究所国际理事会遗传学主席Joseph Ecker总结表示，“目前的方法需要筛选数百种转基因品系，来寻找性能良好的、没有额外插入的品系。这项技术可以提供更有效的方法。这是一个真正的起点，它意味着我们可以结合使用最新的图谱和测序技术，来研究在植物基因组中插入一段基因可能发生的影响。拟南芥的基因组非常小，所以相对容易。但随着DNA测序技术的持续提升，我们预见这种方法也可以被用于农作物植物。”

参考来源：

https://www.salk.edu/news-release/new-technologies-enable-better-than-ever-details-on-genetically-modified-plants/

纳米孔测序技术：https://nanoporetech.com/cn