Nature Methods黄兆麟团队筛选出可降低脱靶效应的SpCas9变体

来源：BioArt

蛋白质工程（protein engineering）技术在优化抗体、生物酶、基因编辑工具酶等有重大作用。但若要大规模改造并筛选出最佳的蛋白质变体并非易事。现有的方法中，定点突变因工作量限制很难作高通量筛选；基因合成造价高昂且存在每千碱基有1至10个错误的风险；其他方法，比如同源重组，虽然可以同时构建不同的突变体，然而后期却很难实现高通量表征每一个突变体。

针对这个难题，2019年7月15日香港大学的黄兆麟（Alan S. L. Wong）博士课题组在Nature Methods上发表了一篇题为Combinatorial mutagenesis en masse optimizes the genome editing activities of SpCas9的文章，通过其命名为CombiSEAL的技术成功筛选出了一个SpCas9变体，Opti-SpCas9，使其在不损失活性及靶点选择范围的前提下降低脱靶效应（off-target effect）。

CombiSEAL技术首先将编码目标蛋白的DNA序列分切成若干部分，在每部分的序列中引入多个突变以形成子文库（sub-library），并在序列末端合成条码（barcode）以区分各个突变。其次，在第一部分子文库的基础上通过Type IIS限制性内切酶将第二部分子文库无缝插入到第一片段基因序列与barcode之间。以此类推，最终形成包含各个突变随机组合的蛋白突变体文库，每一个组合都由一个对应的组合条码标识（图1）。基于CombiSEAL合成的蛋白突变体文库不但满足了高通量筛选的要求，并且可以通过barcode对每一种可能的突变组合进行表征。

图1.CombiSEAL改造SpCas9示意图

黄博士团队利用CombiSEAL技术构建了包含948种突变组合的SpCas9文库。旨于筛选出比野生型SpCas9有更低脱靶效应且不限制其活性的突变体，作者合成了两对靶向红色荧光蛋白（RFP）的sgRNA，部分与靶向DNA序列完全互补（on-target），而另一部分包含一个或多个不匹配碱基（off-target）。利用分别包含这些sgRNA的报告细胞系，作者对SpCas9突变文库进行了高通量筛选。通过比较RFP敲除水平，作者筛选出Opti-SpCas9（图2）。

图2.高通量SpCas9突变体筛选策略

作者随后将Opti-SpCas9与当下Nature、Science等前沿期刊中报道的若干SpCas9突变体进行了比较与表征。首先，作者考察了sgRNA 5’-G对各个SpCas9突变体的活性影响。5’-G是广泛应用于sgRNA表达的启动子，U6，的转录起始信号。野生型SpCas9可以兼容5’端多一个G的sgRNA（即，GN20），而eSpCas9（1.1），SpCas9-HF1， HypaCas9，evoCas9 和Sniper-Cas9等突变体却不能与之兼容或活性较低，从而限制了这些突变体的应用。然而作者发现，Opti-SpCas9的活性并不受其影响，与野生型无异。同时，当sgRNA是以5’-G起始时（即，GN19），虽然Opti-SpCas9，eSpCas9（1.1）和HypaCas9均与野生型活性相差无几，但是GN19这类sgRNA却大大限制了CRISPR-Cas9的靶点选择范围。此外，作者还考察了另一项决定Cas9临床应用的指标，脱靶效应。研究发现Opti-SpCas9的脱靶效应显著低于野生型Cas9，并与上述诸多突变体保真性相当。

综上，Opti-Cas9在不损失野生型SpCas9的活性及靶点选择范围的同时大幅提高了其保真性，为后继实验提供了一个新的选择。黄博士课题组通过CombiSEAL技术成功地筛选出了Opti-SpCas9，充分地展示了该技术在蛋白质工程中的潜力，为以后改造其它蛋白质的工作提供了一个新颖高效的平台。

以下是黄博士早前于Nature Biotechnology及PNAS等发表开发其他高通量筛选平台(CombiGEM and CombiGEM-CRISPR)的相关文章:

1    Wong, A.S.L., Choi, G.C.G., Cheng, A.A., Purcell, O. & Lu, T.K. Massively parallel high-order combinatorial genetics in human cells. Nature Biotechnology 33, 952-961 (2015).

2    Wong, A.S.L. et al. Multiplexed barcoded CRISPR-Cas9 screening enabled by CombiGEM. Proc Natl Acad Sci U S A 113, 2544-2549 (2016).

3    Wong, A.S.L., Choi, G.C.G. & Lu, T.K.Deciphering Combinatorial Genetics. Annual Review of Genetics 50, 515-538 (2016).

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41592-019-0473-0