美国明尼苏达大学揭示基因调控信息助力作物遗传改良的作用及局限性！

来源：植物科学最前沿

原标题：Trends in Plant Science|美国明尼苏达大学揭示基因调控信息助力作物遗传改良的作用及局限性！

农业物种改良利用了复杂数量性状的遗传变异，许多基因通过顺式调控元件和反式调控元件的作用产生基因表达差异。然而，识别基因调控网络的组成部分，对于预测重要性状的基因至关重要。当重要基因被调控时，提高植物的生产力或恢复力是一个挑战。

近期，TRENDS IN PLANT SCIENCE杂志在线发表了美国明尼苏达大学题为“Challenges of Translating Gene Regulatory Information into Agronomic Improvements”的文章，本文讨论了利用从基因共表达、转录因子结合以及全基因组关联图谱分析中获得的数据预测影响作物改良调控作用的的机会和局限性。这些数据的信息组合对于可靠地识别和利用重要农艺性状调控作用是必要的。

基因调控和遗传变异

基因表达的控制对细胞活动的各个方面都至关重要。这一过程的基础是转录因子(TFs)。TFs通过招募、相互作用或修改转录机制的成分来激活或抑制特定目标基因的转录。事实上，正是通过特定的蛋白-蛋白和蛋白-DNA（PDIs）相互作用，将数十至数百个TFs连接到调控区域的协同作用，使得基因能够以适当的表达模式表达。

遗传变异描述群体中个体之间和群体之间的基因型差异，提供了选择所需的多样性底物。TF位点的遗传变异会影响TF丰度或TF活性，可能导致靶基因的跨调控变异。另外，目标基因的顺式调控元件（CREs）上的DNA序列的改变可以导致顺式调控的变异。理想性状的育种通常包括选择表达水平改变的变异等位基因，这要么是由于CREs等位基因的变异，要么是由于相应的TFs活性或表达的差异。顺式和跨调节变异的相对影响可以通过调节多样性的表达量性状位点(eQTL)作图或通过分析与亲本相关的表达水平来评估。植物物种调控变异的研究已经发现了丰富的顺式和跨调控变异。从酵母和人类中获得的经验表明，大多数表达变异来自于反式eQTLs ;这种情况在植物中是否也普遍存在还有待确定。在已经发现的影响的频率和程度上存在差异，这些影响可以反映种群之间的生物变异，通过创造新的等位基因，或选择特定的等位基因组合，将这一知识应用到作物改良中，提高对构成反式或顺式调控变异基础的特定DNA序列变化的理解将是重要的。

利用调控变异来影响植物性状时，将重点放在调控反式因子上。观察到一个或一小组TFs可以调节(代谢)通路的多个步骤，这表明改变TFs的活性或表达模式往往比改变通路单个基因的CREs对代谢的影响更大。为了开发TFs影响特定通路或性状的路线图，关键是开发基因调控网络(GRNs)，提供有关TF-靶基因相互作用的功能信息。这种类型的知识提供了利用有针对性的基因组修饰来开发对植物性状具有可预测影响的新等位基因进而影响结果的思路。

阐明基因调控网络（GRNs）的途径

与RNA丰度相比，大多数植物的功能基因变异对基因转录也有重要要影响。基因转录的核心是GRNs。GRNs是基因调控网格的时空表现形式，描述了生物体中所有基因表达所必需的复杂功能PDIs网络。因此，描述GRNs的一个关键步骤是确定包含TFs和相应靶基因的PDIs。测定PDIs的方法可分为以基因为中心的方法和以TF为中心的方法。基因为中心的方法，如酵母单杂交(Y1H)，允许识别结合特定基因启动子的TFs。使用规范化的TF Y1H文库，而不是整个cDNA文库，显著提高了“真正的相互作用的比例，但消除了识别新的DNA结合蛋白的可能性。然而，通过Y1H鉴定PDIs有许多限制，包括只鉴定涉及小(通常为1Kb) DNA诱饵区域的相互作用，而需要多个TF或植物特异性TF翻译后修饰的PDIs将被遗漏。

以TF为中心的方法包括色谱免疫沉淀(ChIP)和DNA亲和纯化(DAP)分析，当结合大规模并行DNA测序(如ChIPSeq和DAP- seq)时，可以同时识别数千个潜在的TF靶基因。到目前为止，绝大多数假定的植物PDIs是通过以TF为中心的方法确定的。ChIP-Seq允许捕获体内TF-靶相互作用，但它也可以识别被TF间接绑定的靶序列(例如，通过另一个TF)。由于ChIP-Seq需要抗体的可用性，并且依赖于相当可变的蛋白质DNA交联和免疫沉淀现象，所以实施起来既费时又昂贵。相比之下,DAP-Seq允许更高的吞吐量和不贵,但错过PDI需要多个TFs或要求TF转录后修饰,和不尽被DAP-Seq体内难以接近的染色质区域内,因此不会真正用于TF绑定。ChIP-Seq的生物相关性的评估或DAP-Seq浓缩在一个特定的轨迹常常利用转录组分析功能丧失TF的等位基因。然而，在许多作物中，全基因组功能缺失基因型的资源有限，不能用于从这些TF-target相互作用方法中推断出的GRNs。

解释以基因和TF为中心的方法得到的结果的一个挑战是，当所涉及的TF的表达受到干扰时，所识别的PDIs常常对mRNA积累几乎或没有影响。虽然在某些情况下，技术伪影导致了靶基因和差异表达基因之间的低重叠，但更常见的情况是TF冗余、平稳和短暂的TF-target相互作用，以及仅在取样细胞的一小部分中TF对靶基因的调控起着的作用。由于这些原因，从特定PDIs的生物学意义来看，将TF招募到特定的基因调控区域而不影响基因表达被解释为非结论性。此外，很难确定哪一种PDIs影响最大，尤其是因为通常是多个TFs与一个调控区域的组合相互作用决定了对基因表达的影响。

推断调控网络的补充方法是使用统计推断算法或应用于基因表达数据的机器学习技术。在最简单的情况下，人们普遍认为具有非常相似的mRNA积累模式(共表达)的基因在功能上是相关的，并受涉及共享TFs的类似机制调控。基因共表达网络(GCNs)和GRNs捕捉特定的基因表达时空模式，可作为识别基因参与特定通路或过程的有效工具。然而，用于构造GCNs的特定方法(例如，相关方法和使用的数据集)会对生成的GCN[产生显著影响。然而，通过全基因组关联研究(GWAS)在玉米中发现的潜在性状，GCNs在确定基因优先级方面是有用的。此外，计算推理方法已被用于构建GRNs，并发现在植物生长发育过程中涉及的重要基因和调控关系。已经开发了几种方法来利用带注释的TFs知识从GCN数据创建假定的GRNA。这些共表达衍生的GRNA通常对已知目标表现出一定的富集，但也包含许多PDI数据集中没有观察到的假定边缘。总之，有许多方法可以用来发现GRNs并评估它们的影响。每一种方法都有潜力为这种理解提供额外的价值和新颖的见解，但是假阳性和假阴性的交互可能会预先处理后续步骤，从而使完整的GRNs的生成复杂化。在寻找最佳策略来集成解释完整GRNs中使用的不同方法的输出方面存在挑战。分析和验证GRNs的一个关键工具是在TFs中使用功能缺失突变体。提高扩大方法的能力，以便系统地阐明和评估作物品种中个别TFs，将大大增加对生物学上相关的GRNs的了解。

将自然变异与GRNs联系起来的机遇与挑战

在一些模型物种中，GRNs可以通过使用突变体库来测试和探索，突变体库可以系统地探测所有基因的功能。正向基因筛选已经在作物植株的许多TFs中发现了突变体，在某些情况下，这些突变体已被用来洞察作物性状中的关键GRNs。然而，系统的全基因组TFs筛选目前在作物中还不可行，正向遗传方法可能由于基因冗余和无效等位基因的丧失而变得复杂。这限制了测试由TF中心、基因中心或共表达数据开发的GRNs的能力。对作物物种内部自然变异的研究为检验GRNs提供的一些基因调控预测提供了机会。在作物品种中，不同品种间的基因表达水平甚至基因含量存在着广泛的差异。这为利用导致TF存在表达差异的自然变异来评估假定的靶基因是否改变了表达提供了机会。此外，与功能极端缺失或功能获得突变形成对比的是，在自然变异环境中，变异状态的不同构象的存在，使研究人员能够同时测试TFs和目标基因的多种组合，特别是在具有大种群规模的不同关联面板的情况下。这些方法也可以扩展到研究野生和驯化种群或相近物种的网络差异。

专注于研究自然变异的方法具有同时发现GRNs中支持的边缘的好处，并为利用这些等位基因改进作物提供了机会。GWAS鉴定的数量性状位点通常占性状变异的相对较小比例，但一旦鉴定出来，变异可以通过转基因或编辑方法得到增强或抑制。这可能导致产生等位基因序列的能力，具有比在自然群体中观察到的等位基因更大的表型效应。虽然基因表达水平可能受到CREs变化的影响，但TF变异体由于控制多个靶基因，有可能产生更大的影响。因此，重点研究具有支持作用的TFs在GRNs中的特征，有助于揭示影响植物性状的关键控制点。

许多研究通过对双亲群体或关联小组的分析，有效地利用自然变异来探索许多数量性状的遗传基础。许多研究强调了基因调控作为控制可见表型变异机制的重要性，重要的是，在许多例子中，发现了导致TFs表达模式改变的自然变异，而不是真正失去功能的等位基因，这突出了通过操纵TFs而产生农艺性状的潜力。最近将GWAS和GCNs结合起来的方法提出了整合多个证据片段的方法，以优先选择高质量的候选基因，并验证GRNs。然而，这些研究将面临一个关键的限制，因为对自然变异的分析仅限于存在于种群中的变异。许多作物品种的改良系的种群都受到了强烈的选择压力。关键TFs的变异可能导致表型发生强烈的多效性变化，选择支持或反对，而环境的影响可以加剧或改善这种变化。这意味着许多关于自然变异的调查将局限于在改良品种中可以容忍的变异，并且可能已经丢失了在探索GRNs中有用的关键变异。这也将限制利用GRNs知识通过传统植物育种方法培育良种的潜力。转化效率的提高和可用种质范围的扩大为探索在特定扰动(特别是在自然界占主导地位的)存在下，背景变异对更广泛的自然多样性的影响提供了可能。

利用GRNs改良作物

虽然作物的自然变异可能受到限制，但利用GRNs知识开发良种还有其他潜在途径。转基因方法或基因组编辑可用于显著的TFs，以创建在自然种群中不具有代表性的新等位基因，并驱动更高水平或新的表达模式。这些变化可能导致靶蛋白表达的改变，从而调节通路的结果。或者，基因组编辑可以用来靶向关键TFs的远端调控区域，从而创建内源性基因的新模式或表达水平。在这两种情况下，它们都可能提供替代功能丧失的等位基因的方法，这些等位基因通常由正向遗传学方法产生，并可能产生新的性状。最近对番茄发育关键调控因子的研究表明，调控CREs可以产生自然界未见的变异，从而导致新的表型。利用染色质图谱识别远端调控元件的能力的提高将指导努力创造新的TFs等位基因，这些基因可以被筛选出来，以提高农艺性能。调控TFs的潜力可以模拟植物驯化改良过程中观察到的等位基因的产生。

展望

尽管技术有了长足的进步，对细胞功能的理解也在不断提高，但由于连接基因型和表现型的动态复杂网络，从基因组中预测性状的能力受到了限制。植物育种业务继续投入大量资源，用于将QTL或转基因基因导入多个遗传背景的转化部分。众所周知，背景效应对产生的表型有重大影响，并可能限制QTL或转基因的应用能力。传统上，转基因整合也倾向于采用正向育种方法，以解释对内源等位基因的潜在依赖，内源等位基因可以与环境中的特定事件相互作用。对于每一种情况，特征良好的功能性基因变异的合理组合都可以提高育种结果的效率。专注于更好地描述网络架构和动态的策略，包括功能依赖与基因依赖的作用以及常见调控变异与罕见调控变异的优势，除了更好地理解基因组的哪一部分起调控作用外，人们还希望能对提高农艺性状的有效策略提供一些见解。