何爱彬组开发高通量、普适性单细胞ChIP-seq技术——CoBATCH

来源：BioArt

原标题：Molecular Cell：何爱彬组开发高通量、普适性单细胞ChIP-seq技术——CoBATCH

单细胞测序技术目前被广泛用于研究发育与疾病相关细胞群体异质性和绘制细胞图谱。随着技术的发展，这项技术正逐渐将生命科学研究推进到新的维度。在单细胞表观组领域，虽然DNA甲基化测序、染色质构象捕获技术、染色质开放程度测序已经分别在2013年 (scRRBS【1】)、2013年 (single cell Hi-C【2】)、2015年 (scATAC-seq【3】)实现了单细胞水平测序。研究基因表达调控与细胞命运决定的机制，最直接的证据是特定染色质区域与蛋白的相互作用，然而，高效的单细胞染色质免疫共沉淀测序（scChIP-seq）技术尚未出现。 

蛋白质和DNA相互作用的染色质免疫共沉淀技术（ChIP-seq）技术是研究表观遗传调控的一种重要手段，常规ChIP-seq技术需要使用超声打断交联的基因组片段，然后用特异性抗体富集含有目的蛋白结合的基因组片段，并将目的DNA片段纯化后，进行建库测序。这一系列操作使得ChIP-seq需要百万个细胞作为起始材料。为减少ChIP-seq技术对细胞数目的要求，近年来，一些适用于少量细胞起始的ChIP-seq技术被逐渐开发出来，包括MOWChIP【4】，STAR-ChIP【5】和ULI-NChIP【6】等。虽然Drop-ChIP【7】第一次实现了单细胞水平ChIP-seq，然而这一技术依赖特殊的微流控装置，并且每个细胞只能捕获到约800个DNA片段，这极大地限制了这项技术的推广应用。随后开发的scChIC-seq【8】虽然实现了单细胞水平的解析，但是获得的单细胞数据的基因组比对率只有约6.1 %，大大增加了测序成本，且通量较低。另外，Cut&Tag【9】需要依赖Takara ICELL8这一特殊装置。综上，目前还缺乏一种具有普适性，易操作，高质量的单细胞ChIP-seq技术。 

2019年8月27日，北京大学何爱彬课题组在Molecular Cell在线发表了题为 CoBATCH for high-throughput single-cellepigenomic profiling的文章，报道了一种新的具有普适性、易操作、高通量和高质量的单细胞ChIP-seq技术，将单细胞表观组学新技术的研究、普及和应用往前推进了一大步。研究者把这一新型单细胞技术命名为CoBATCH（combinatorial barcoding and targeted chromatinrelease）。这一单细胞技术不仅适用于各种组蛋白修饰，同时也能捕获DNA结合蛋白质在基因组上的结合信息。利用这一单细胞技术，研究者首次解析了小鼠胚胎10个不同器官（心脏、肝脏、肺、左脑、右脑、后脑、肾脏、皮肤、肌肉和小肠）的内皮细胞谱系发育、分化和功能的异质性。 

研究人员首先开发了一种新的适用于少量起始细胞的技术，并命名为in situ ChIP（即不需要消化分离细胞组织）。在这一技术中，作者将Protein A蛋白与转座酶Tn5的N端进行融合得到融合蛋白Protein A-Tn5 (PAT)。将目的细胞与特定抗体孵育之后，向细胞中加入PAT融合蛋白并与特定的抗体结合。之后，激活PAT的反应活性，被抗体识别的特定基因组区域能被PAT切割，并带上接头序列。终止反应后，带上接头的目的DNA片段能直接用于PCR和建库（图1）。

图1 少量细胞 in situ ChIP技术原理图

重要的是，这一少量细胞in situ ChIP技术可直接用于不经过消化的胚胎样品和组织切片。研究人员对小鼠E6.5, E7.0和E7.5未经消化的整个胚胎进行H3K27ac和H3K4me3 insitu ChIP-seq，发现这些组蛋白修饰在胚胎发育相关的特定基因组区域有明显的富集，GO分析表明，这些特异富集的信号与胚层发育过程密切相关。另外，研究人员证明in situ ChIP同样适用于捕获少量细胞转录因子在基因组的结合信息。因此，in situ ChIP对样品本身没有限制，原管操作简单方便，实验能在一天内完成，大大提高了ChIP的效率，有极强的应用价值和普适性。

进一步地，研究者对in situ ChIP进行拓展，创造性地将PAT处理基因组DNA与组合标签标记单细胞两种方法结合起来，首次开发出具有高通量特性和普适性的单细胞ChIP-seq方法，命名为CoBATCH（图2）。其原理是将孵育完抗体的细胞分到不同的孔，用带有不同barcode的PAT进行切割后使细胞带上第一轮标签，然后将所有细胞合并，重新分配到不同的孔，最后用不同的PCR引物进行扩增使细胞带上第二轮标签。利用这一方法，研究人员能在每一个单细胞中捕获平均12,000个非重复DNA片段，且一次实验通量可达10000单细胞。与其他单细胞ChIP-seq技术相比，CoBATCH具有更高的准确性，信噪比，基因组比对率，并能捕获更多的单细胞DNA片段。

图2 高通量单细胞ChIP-seq CoBATCH 技术流程图

内皮细胞组成了哺乳动物体内的脉管系统，和血液循环、造血、免疫、压力感应以及器官形态建成等生命活动密切相关。研究者应用CoBATCH技术解析了小鼠胚胎期16.5天，来自10个器官的Cdh5+ 谱系的内皮细胞的H3K27ac水平的异质性，通过系统的生物信息学分析，作者精确地识别了不同的细胞亚群，它们分别与动静脉的发育，内皮-间质转化（EndoMT）等过程相关，并且，不同器官来源的细胞可能保留着胚层发育的表观信息。有趣的是，作者还鉴定了一群与免疫相关的细胞，它们可能参与了免疫系统的发育和调控。同时，心脏内皮谱系的细胞也表现出很强的内部的异质性，作者用RNA Pol II和H3K36me3 CoBATCH单细胞数据识别出巨噬细胞样细胞，间质细胞和内皮细胞等不同的细胞类型。这些研究结果证明了CoBATCH可以解析不同器官来源的内皮细胞表观异质性以及顺式作用元件在发育过程中的动态变化，为理解器官功能特异的内皮细胞发育提供了重要线索。

简而言之，CoBATCH技术是第一个具有普适性、高质量、高通量的单细胞ChIP-seq方法，该技术将在单细胞水平上为解析细胞命运决定和功能异质性的表观遗传调控机制提供强有力的支持，并对研究器官发育和疾病发生过程具有重大的意义。据悉，课题组同期开发了另一套截然不同的单细胞ChIP-seq方法，可适应不同的应用，文章也即将在线发表，届时BioArt将第一时间为读者分享和解读。

附通讯作者实验室简介：

何爱彬博士，北京大学分子医学研究所研究员，北大-清华生命科学联合中心研究员。实验室成立于2014年，主要研究方向为：1. 哺乳动物器官发育、再生（包括心脏和血液系统）的细胞命运调控机制。为此，课题组利用已有和开发全新单细胞表观遗传技术，高通测序技术和体内外功能基因组验证手段；2. 实时成像结合数字细胞谱系绘制阐明器官发育、再生的细胞与分子机制。“seeing is believing”, 课题组搭建适应哺乳动物胚胎发育的大视野光片显微镜 ，综合运用遗传标记小鼠，高通量图形图像处理和数字谱系，以期用更加直观方式和定量的手段研究在体全细胞（in vivo and in toto）行为规律。近期课题组发表了一系列相关文章。2019年5月， 在Circulation Research杂志在线发表题为“Replication-independent histone turnover underlines the epigenetic homeostasis in adult heart”的研究成果，该研究发现与不增殖成体心肌细胞的较长寿命相比，复制非依赖型的核小体更新较快；该机制可控制调控区域的组蛋白乙酰化修饰水平，对心脏功能稳态起重要作用。2019年6月，在Circulation Research杂志在线发表题为“Single-cell transcriptomics reveals chemotaxis mediated intra-organ crosstalk during cardiogenesis”的研究成果，该研究首次发现趋化作用介导了原始心管对这一波心脏干细胞迁移的直接调控作用，为理解早期心脏不同心区的发育和先心病的治疗提供了重要的理论依据。2017年5月17日， 在Circulation Research杂志在线发表题为“Divergent requirements for EZH1 in heart development versus regeneration”的研究成果，研究揭示同一表观调控因子EZH1在心脏发育和再生过程中，产生不同的组蛋白修饰，导致截然不同的分子机制，调控发育与再生两个关联的生物学过程。2017年4月10日，在eLife上发表了题为“ EED orchestration of heart maturation through interaction with HDACs is H3K27me3-independent”的研究论文。该研究回答了组蛋白修饰H3K27me3还是其修饰酶PRC2本身发挥抑制基因转录的直接作用这一关键科学问题。

原文链接：

https://doi.org/10.1016/j.molcel.2019.07.015

参考文献

[1] Guo, H., etal., Single-cell methylome landscapes of mouse embryonic stem cells and earlyembryos analyzed using reduced representation bisulfite sequencing. Genome Res,2013. 23(12): p. 2126-35.

[2] Nagano, T.,et al., Single-cell Hi-C reveals cell-to-cell variability in chromosomestructure. Nature, 2013. 502(7469): p. 59-64.

[3] Buenrostro,J.D., et al., Single-cell chromatin accessibility reveals principles ofregulatory variation. Nature, 2015. 523(7561): p. 486-90.

[4] Cao, Z., etal., A microfluidic device for epigenomic profiling using 100 cells. NatMethods, 2015. 12(10): p. 959-62.

[5] Zhang, B.,et al., Allelic reprogramming of the histone modification H3K4me3 in earlymammalian development. Nature, 2016. 537(7621): p. 553-557.

[6]Brind'Amour, J., et al., An ultra-low-input native ChIP-seq protocol forgenome-wide profiling of rare cell populations. Nat Commun, 2015. 6: p. 6033.

[7] Rotem, A.,et al., Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatinstate. Nat Biotechnol, 2015. 33(11): p. 1165-72.

[8] Ku, W.L.,et al., Single-cell chromatin immunocleavage sequencing (scChIC-seq) to profilehistone modification. Nat Methods, 2019. 16(4): p. 323-325.

[9] Kaya-Okur,H.S., et al., CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samplesand single cells. Nat Commun, 2019. 10(1): p. 1930.