李祥/阮永怡/黄永瀚合作揭示组蛋白戊二酰化对核小体动态结构的影响

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原标题：Molecular Cell：李祥/阮永怡/黄永瀚合作揭示组蛋白戊二酰化对核小体动态结构的影响

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在真核生物中，核小体是构成染色质的基本单元，其中的组蛋白为DNA的缠绕提供支持结构。组蛋白的翻译后修饰可以影响组蛋白之间、组蛋白与DNA、甚至不同核小体之间的相互作用，进而对基因的开放程度和转录，以及DNA的复制、损伤后修复等等过程进行调节。其中赖氨酸（K或Lys）位点存在多种化学修饰，例如乙酰化（Kac）和泛素化（Kub）。受益于质谱技术的发展，近年来有更多的新型赖氨酸酰基化被报道，包括巴豆酰化（Kcr），2-羟基异丁酰化（Khib），β-羟基丁酰化（Kbhb）等。在新发现的修饰中，赖氨酸丙二酰化（Kmal）、琥珀酰化（Ksucc，也叫丁二酰化）和戊二酰化（Kglu）在结构中均含有末端羧基，在正常生理条件下，能将赖氨酸氨基携带的正电荷转变为负电荷，有可能显著改变蛋白底物的结构和功能。但相关研究尚处于起步阶段，学界对于此类修饰的生物学意义理解亦不深入。

图1. 开发戊二酰化化学报告基团检测赖氨酸戊二酰化（上）。赖氨酸戊二酰化存在于多个组蛋白位点（下）。

赖氨酸戊二酰化修饰（Kglu，图1）最早发现于线粒体蛋白并参与调节细胞代谢【1】。最近的研究还显示，Kglu还与人类精子的运动能力相关【2】。组蛋白H2A上也发现有3个Kglu修饰位点【1】，但其功能未知；目前对组蛋白上Kglu的修饰亦缺乏系统性的研究。

2019年9月18日，香港大学化学系李祥（Xiang David Li）课题组联合生物系阮永怡（Karen Wing Yee Yuen）课题组及医学院黄永瀚（JasonWing Hon Wong）课题组（李祥课题组博士后鲍秀丛为第一作者）在Molecular Cell杂志上发表了题为Glutarylation of Histone H4 Lysine 91 Regulates Chromatin Dynamics的文章，首次系统性的鉴定了人类组蛋白上存在的27个Kglu位点，并对进化上非常保守的H4K91位点Kglu修饰的功能进行了深入研究。

为了系统性的鉴定Kglu修饰的蛋白谱，研究人员应用化学生物学方法，首先设计并合成了戊二酰化特异性的化学报告基团（chemical reporter），GluAM-yne（图1）。该分子在戊二酸的第三位碳原子上加装了末端炔烃，并对两个羧基进行了乙酰羟甲基酯化；在GluAM-yne被细胞摄入并对蛋白Kglu修饰之后，应用CuAAC 点击反应（copper(I)-catalyzed alkyne-azide cycloaddition(CuAAC) “click” reaction）即可对被修饰的蛋白进行Tag标记，从而可以分析Kglu修饰蛋白组。应用该方法，研究人员发现，此化学探针成功的标记并富集了已知的Kglu修饰的线粒体底物，GAPDH和CPS1, 此外还发现Kglu修饰主要发生在细胞核内，并且H2A/H2B/H3/H4组蛋白上均存在大量的Kglu修饰。在对人组蛋白进行了液相色谱串联质谱分析（Liquid chromatography–mass spectrometry）后，研究人员在人组蛋白上检测并鉴定出27个Kglu位点（图1）。

其中组蛋白H4球状结构域K91位点的Kglu修饰引起了研究人员的关注。该位点赖氨酸位于核小体内组蛋白H3/H4四聚体与H2A/H2B二聚体之间的界面，并与H2B上的谷氨酸残基形成盐桥以稳定核小体。当H4K91位点赖氨酸被戊二酰化修饰之后，原本带有正电荷的赖氨酸变成了携带负电荷，因此很可能影响核小体的稳定性。为研究Kglu修饰对于核小体结构的影响，研究人员需要制备高纯度并且带特定位点Kglu修饰的组蛋白。为解决上述问题，李祥课题组利用表达蛋白连接技术的化学合成手段（expressed protein ligation, EPL），成功合成了具有Kglu修饰的H4K91组蛋白。通过凝胶迁移滞后实验（electrophoretic mobility shift assays，EMSA），研究人员发现Kglu修饰阻碍组装组蛋白八聚体的形成及其稳定性。进一步的荧光共振能量转移方法（Fluorescence resonance energy transfer,FRET）定量研究该位点的Kglu修饰对核小体结构的稳定性的影响程度，揭示了Kglu修饰通过影响组蛋白间的相互作用从而影响核小体的稳定性。

为了更系统的探究H4K91glu的分布及功能，研究人员构建了H4K91glu特异性的多克隆抗体，并且发现该修饰在进化上高度保守。由于哺乳动物细胞中组蛋白基因有很多拷贝数，研究人员选择了出芽酵母进行了H4K91E（赖氨酸变为谷氨酸，谷氨酸携带两个羧基，可以模拟戊二酰化修饰）点突变。研究发现H4K91E突变使得染色质的结构发生改变，从而导致端粒区域的基因转录水平上升，同时酵母细胞的染色质聚集程度也相比野生型降低, 也使得酵母细胞的细胞周期受阻，并增强了其对DNA损伤高度敏感性。此外，RNA-seq测序分析也显示，H4K91E突变使得数百种原本低丰度表达的基因的转录水平显著上调。这些结果进一步佐证了H4K91glu修饰对核小体结构的疏松作用，并对基因转录、DNA损伤后修复和细胞周期具有重要的调控作用。

那么，什么分子对组蛋白上的Kglu修饰进行调节呢？早期的研究显示，大量定位于线粒体中的去酰化酶Sirt5具有去除Kglu修饰的作用【1】。李祥课题组的研究人员发现，干扰Sirt5并不影响组蛋白上Kglu修饰水平，而定位于细胞核内的Sirt7才是组蛋白Kglu的关键去修饰酶。体外实验显示，重组表达的人源Sirt7可以高效的将Kglu修饰从H4K91glu多肽以及合成组蛋白上去除。有意思的是，Sirt7的去戊二酰化作用依赖NAD和DNA的同时存在。细胞内实验表明干扰Sirt7表达显著上调H4K91glu水平，而过表达Sirt7显著下调H4K91glu修饰。在细胞进行有丝分裂或者遭遇DNA损伤时，核小体会快速组装使得染色体浓缩；研究人员发现，此过程也依赖Sirt7介导的H4K91glu去修饰作用。此外，李祥课题组还发现，已知的组蛋白乙酰转移酶KAT2A通过与α-酮己二酸脱氢酶复合物（α-KADH，介导α-酮己二酸向戊二酰辅酶A的转化）中的DHTKD1蛋白直接结合，介导组蛋白赖氨酸的戊二酰化修饰，并揭示KAT2A的乙酰/琥珀酰/戊二酰转移酶功能的实现分别依赖于与其相结合的复合物结构, SAGA，α-KGDH [3]，α-KADH。对人源细胞进行染色质免疫共沉淀后测序分析（ChIP-seq）显示，与KAT2A基因组分布相一致，H4K91glu主要在转录起始位点附近区域富集，并且在高丰度表达的基因中富集程度更高。这再次验证了H4K91glu疏松核小体结构，促进基因开放程度的功能（图2）。

图2. 组蛋白戊二酰化由Sirt7和KAT2A-aKADH复合物共同调控。该修饰通过改变核小体动态结构参与基因转录的调控。

这些研究首次全面的鉴定出了Kglu在人组蛋白中的27个分布位点，系统的分析了进化上保守的H4K91glu修饰对核小体组装、基因表达、DNA损伤后修复、细胞周期等染色质相关功能的重要调控作用，从基因组学水平分析了H4K91glu分布图谱，并鉴定出了组蛋白戊二酰基转移酶（KAT2A）和去戊二酰化酶（Sirt7）。

原文链接：

https://www.cell.com/molecular-cell/pdf/S1097-2765(19)30657-4.pdf 

参考文献

1. Tan, M., et al., Lysine glutarylation is a protein posttranslational modificationregulated by SIRT5. Cell Metab, 2014. 19(4):p. 605-17.

2. Cheng, Y.M., et al., Lysine glutarylation in human sperm isassociated with progressive motility. Hum Reprod, 2019. 34(7): p. 1186-1194.

3. Wang, Y., et al., KAT2A coupled with the alpha-KGDH complexacts as a histone H3 succinyltransferase. Nature, 2017. 552(7684): p. 273-277.