Nature ：模拟人肝胆胰腺多器官发生的类器官模型

来源：BioArt

人类器官发生过程复杂、精妙而有趣，器官之间的边界形成对于正常的人体生长是非常重要的【1,2】。在复杂环境中连续的、动态的器官发生可能是由邻近组织相互作用驱动的【3】。长期以来，科学家们囿于没有合适的研究模型而未能对人类器官发生过程进行详细地研究，因此对于相邻的组成部分如何协调起来建立一个完整的多器官结构还很不清楚。

为了对器官形成过程以及器官边界建立进行研究，2019年9月26日，辛辛那提儿童医院Takanori Takebe研究组在Nature杂志上发表了文章Modelling human hepato-biliary-pancreatic organogenesis from the foregut–midgut boundary，建立了肝胆-胰腺的3D类器官模型。

肝胆-胰腺器官形成过程由于技术难度较大，一直以来都没能在机制方面有所突破【4,5】。Takebe研究组首先使用人类多能干细胞的3D分化方式（Three-dimensional differentiation approach）建立具有不同区域结构的内胚层与中胚层的肠道球状体结构，可以使用类器官技术对人类肝胆-胰腺的内在特化过程以及内陷过程进行模拟。为了建立前肠和中肠的分界线，作者们首先将特定的内胚层细胞暴露出在有或无BMP拮抗剂的情况下控制前部或者后部肠道细胞的命运（图1a）。前肠细胞表达SOX2标记物，而后肠表达CDX2标记物。而两种类器官球状体在融合后，肝脏早期标记物以及十二指肠以及胰腺祖细胞早期标记物仅会在两类器官的边界处表达，并且随着培养的时间增长，边界表达肝脏以及胰腺标记物的细胞会逐渐增多（图1b）。而且实验表明肝脏-胰腺祖细胞平衡的建立需要的有前-后部的融合。前-后部的融合使得肝脏-胰腺祖细胞自组装建立形成一定的模式结构。

图1 类器官边界产生多种内胚层的结构

随后，为了进一步确认对所建立的肝脏-胰腺类器官进行可视化探究，作者们通过CRISPR-Cas9基因编辑技术将肝脏、胆管以及胰腺所共有的祖细胞标记物PROX1（Prospero-related homeobox 1 protein）与红色荧光蛋白相融合建立了一个人类诱导多能干细胞的报告细胞系，对形成的祖细胞命运进行追踪。作者们发现，PROX1同样是表达在边界区域并随着培养时间的增长而表达量逐渐增加。这更进一步说明了在没有内源诱导因子存在的情况下，类器官的边界出现了肝脏-胰腺祖细胞。

为了对肝脏-胰腺祖细胞在类器官边界出现的自诱导机制进行解析，作者们想要知道在类器官的边界是否出现了特定表达的诱导信号通路。通过RNA-seq分析后，作者们惊奇地发现，不是FGF、BMP、Hedgehog或者是Notch信号通路出现在两类器官的边界，而是视黄酸信号表达在了边界区域。而加入视黄酸受体拮抗剂之后，边界特异性表达的肝脏早期标记物以及十二指肠以及胰腺祖细胞早期标记物会被显著地抑制。在动物方面的研究表明，视黄酸信号通路在肝脏-胰腺细胞谱系区域分化过程具有非常关键的作用【6,7】。通过荧光流式细胞分选，作者们进一步发现了视黄酸信号的细胞来源，即共分化的前部非上皮细胞，很有可能是间叶细胞谱系。

而且为了确认更长期的培养是否会诱导两种类器官融合并产生高级的组织器官，作者们将肝脏-胰腺类器官长期培养至90天（图2）。第90天的类器官在形态上类似于气液界面系统中生长了四天的E10.5胚胎分离的小鼠外植体。并且实验结果表明类器官边界不仅生成多个肝脏-胰腺器官区域，而且在胰腺（尤其是外分泌谱系）与胆管之间建立了功能联系。

图2 体外培养90天的肝脏-胰腺类器官

HES1(Hes family bHLH transcription factor 1)是调控后部前肠细胞谱系的转录因子，在HES1敲除的小鼠中，由于胆管与胰腺组织器官不能正常分离而出现胆管系统向胰腺组织的转化【8,9】。为了探究肝胆-胰腺类器官的发育过程是否是由HES1调控，作者们建立了HES1敲除的PROX1人类诱导多能干细胞报告细胞系。作者们发现，在培养的第11天HES1敲除的肝脏-胰腺类器官中PROX1的活性以及肝脏早期标记物以及十二指肠以及胰腺祖细胞早期标记物的表达被保留，而在第22天HES1敲除的品系中胰腺相关的HES1靶标基因的表达显著上调，表明HES1的确参与到了类器官边界的建成。

干细胞培养中的多器官整合是一项尚未解决的关键挑战。Takebe研究组的工作解决了类器官边界系统形成的技术难题，建立了能够模拟人体内肝脏-胰腺类器官建成过程的边界系统。 体外连续培养的肝脏-胰腺类器官为研究人类器官早期形成的复杂相互作用过程提供了可能性，并为人类器官发生和疾病模型系统提供了能够产生相互联系的多器官结构。

原文链接：

https://doi.org/10.1038/s41586-019-1598-0

参考文献

1. Smith, D. M., Nielsen, C., Tabin, C. J. & Roberts, D. J. Roles of BMP signaling and Nkx2.5 in patterning at the chick midgut-foregut boundary. Development 127, 3671-3681 (2000).

2. Tepass, U. & Hartenstein, V. Epithelium formation in the Drosophila midgut depends on the interaction of endoderm and mesoderm. Development 120, 579-590 (1994).

3. Bort, R., Martinez-Barbera, J. P., Beddington, R. S. & Zaret, K. S. Hex homeobox gene-dependent tissue positioning is required for organogenesis of the ventral pancreas. Development 131, 797-806, doi:10.1242/dev.00965 (2004).

4. Ameri, J. et al. FGF2 specifies hESC-derived definitive endoderm into foregut/midgut cell lineages in a concentration-dependent manner. Stem cells 28, 45-56, doi:10.1002/stem.249 (2010).

5. Zhang, R. R. et al. Human iPSC-Derived Posterior Gut Progenitors Are Expandable and Capable of Forming Gut and Liver Organoids. Stem cell reports 10, 780-793, doi:10.1016/j.stemcr.2018.01.006 (2018).

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7. Rankin, S. A. et al. Timing is everything: Reiterative Wnt, BMP and RA signaling regulate developmental competence during endoderm organogenesis. Developmental biology 434, 121-132, doi:10.1016/j.ydbio.2017.11.018 (2018).

8. Fukuda, A. et al. Ectopic pancreas formation in Hes1 -knockout mice reveals plasticity of endodermal progenitors of the gut, bile duct, and pancreas. The Journal of clinical investigation 116, 1484-1493, doi:10.1172/JCI27704 (2006).

9. Sumazaki, R. et al. Conversion of biliary system to pancreatic tissue in Hes1-deficient mice. Nature genetics 36, 83-87, doi:10.1038/ng1273 (2004).