all-in-one策略及TMV Ω翻译增强子序列实现基因精确敲入

来源：植物科学最前沿

精确地基因敲入或替换是基因编辑的最终目标。尽管利用同源重组修复途径完成基因打靶被广泛地用于包括哺乳动物在内的各种生物，但在高等植物体内，通过同源修复途径完成基因组修复的效率极低，这大大限制了基因打靶在高等植物中的应用。2018年5月17日，Nature Communications在线发表了中科院上海植物逆境生物学研究中心朱健康研究组题为“CRISPR/Cas9-mediated gene targeting in Arabidopsis using sequential transformation”的研究论文。该研究报道了在拟南芥中使用二次转化策略与CRISPR/Cas9系统的基因片段高效精准敲入/替换技术。它可以在拟南芥基因组中精准地实现大片段的插入或单氨基酸的替换，且编辑位点无需任何标记辅助筛选，效率高达5-10%。此研究大大推进了CRISPR系统在植物中的应用，为植物基因定点编辑提供了一个新方法。然而此方法只能通过分步转化才能获得，较为复杂。

2019年9月25日，Plant Biotechnology Journal杂志在线发表了来自中科院上海植物逆境中心Daisuke Miki组和朱健康课题组合作题为“Gene targeting in Arabidopsis via an all-in-one strategy that uses a translational enhancer to aid Cas9 expression”的研究论文。该研究报道了在原来的方法进行改良，实现了一步到位（all-in-one）的基因打靶方法。

在该研究中，将Cas9蛋白、gRNA和HR修复供体序列一次性全部设计在同一个载体上进行一次转化（如下图所示）。此外，该研究还增加源于TMV的Ω翻译增强子序列以增强Cas9蛋白的表达，在HR供体序列两侧增加sgRNA识别位点及使用具有EC1.1启动子的嵌合EC1.2 / DD45增强子来驱动Cas9表达。

该研究发现，在不使用增强子等元件的条件下，基因敲入的效率只有0.68%。而通过利用源于TMV的Ω翻译增强子序列增强Cas9蛋白的表达，在DD45启动子的驱动下，能将基因敲入的效率提高3倍，达到2.4%。此外，研究发现，EC1.2/DD45的增强子配合EC1.1启动Cas9蛋白的表达，在该体系中并没有效果。在HR供体序列两侧增加sgRNA识别位点，也不能增加基因敲入的效率。

该研究表明，尽管使用all-in-one策略进行基因打靶的效率低于两步法的效率，但是在未来的工作中，将进一步优化all-in-one策略，提高基因打靶的效率，使其能更高效地应用于拟南芥的任一生态型或者基因组背景植株，或其他能使用浸花法转化的高等植物。

本研究由Daisuke Miki研究员和朱健康研究员课题组完成。Daisuke Miki研究员和朱健康研究员为论文的通讯作者，彭方楠硕士和张文心硕士为论文的第一作者。

原文链接：

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1111/pbi.13265