BioTechniques综述：应用于免疫学的单细胞技术

来源：生物通

近日，加拿大不列颠哥伦比亚大学的Jane Ru Choi在《BioTechniques》上发表综述，回顾了单细胞技术的特点及其在免疫学中的应用。

免疫系统由异质性的免疫细胞群体组成。在此，单细胞技术就显得尤为重要。它可以在单细胞水平评估免疫细胞反应，从而确定疾病原因并阐明潜在的生物学机制。近日，加拿大不列颠哥伦比亚大学的Jane Ru Choi在《BioTechniques》上发表综述，回顾了单细胞技术的特点及其在免疫学中的应用。

最近微流控技术有了飞速发展，细胞捕获微流控设备、液滴微流控设备和纳米孔芯片的出现使得人们能够在单细胞水平研究免疫反应。目前，细胞捕获微流控设备被用来研究细胞间互作和细胞迁移。液滴微流控设备则能够大规模产生单个细胞，从而实现单细胞分泌、mRNA测序和细胞间相互作用的分析。

单细胞技术不断应用在免疫学实验中，因此作者认为有必要讨论一下这些技术的最新进展。她首先介绍了每种单细胞技术在免疫学研究中的作用，然后总结了它们的优点和缺点。最后，她还简单讨论了现有挑战和未来前景。

免疫信号的研究

在此，作者讨论了两个技术领域：单细胞分泌和单细胞mRNA测序。

单细胞分泌

目前有两种技术可以测定单细胞分泌：基于液滴的技术和基于纳米孔的技术。

在液滴设备中，每个皮升至纳升大小的液滴可容纳单细胞及其分泌的蛋白质。人们已开发出多个液滴微流控设备来测定单个免疫细胞的分泌，包括抗体和细胞因子。例如，基于荧光共振能量转移的液滴微流控装置能够实现高通量的细胞因子筛选，不过由于缺乏洗涤步骤，这些结果也常常伴随着强烈的背景信号，导致灵敏度低。之后，人们又开发出基于琼脂糖和水凝胶的液体微流控设备。

尽管液滴微流控技术不断发展，但细胞附着表面的缺乏和营养物质的充分扩散限制了它们的广泛应用。为了解决这个问题，人们又开发出纳米孔芯片用于单细胞分泌分析。他们通过光刻技术制造出纳米孔芯片，由数千个不足纳升的小室组成。芯片分为两种类型：密封式纳米孔芯片和开放式纳米孔芯片。

密封式纳米孔芯片由载玻片（其上涂有捕获抗体）密封，涉及细胞培养过程。分泌的蛋白质与载玻片结合，然后用荧光抗体染色进行定量。这种方法可检测T细胞分泌的IFN-γ、IL-2和TNF-α。开放式纳米孔芯片则是将捕获分子包被在孔表面或微珠上，以结合单个细胞释放的蛋白质。与密封式芯片相比，开放式芯片的操作步骤较少，并且能够同时监控单个细胞及其分泌活性，让人们能更轻松挑选出感兴趣的细胞。

单细胞mRNA测序

10x Genomics就是采用液滴微流控设备来检测成千上万个单细胞的mRNA。它将带有条形码和引物的凝胶珠与单个细胞包裹在油滴中，形成单细胞乳液微滴GEM。每个GEM都作为单独的反应囊泡，凝胶珠在其中溶解，捕获每个细胞的目标分子，添加条形码并扩增。借助这项技术，研究人员可对68,000个外周血单核细胞进行测序，有望分析大量的免疫细胞群体。

除了液滴微流控，纳米孔芯片也可以用来分离单细胞。CytoSeq技术便是其中的一种。首先将细胞与新鲜的裂解缓冲液一起添加到含有微珠的纳米孔中。裂解细胞，让mRNA与微珠结合，随后回收微珠进行下游的mRNA测序。经过验证，这种技术可以鉴定免疫反应的细胞异质性。

另一种技术是seqWell，它也是利用纳米孔芯片进行免疫细胞mRNA测序。seqWell的优点是使用了孔径为10 nm的半透性聚碳酸酯膜。这种膜实现了溶液交换，能够快速裂解单细胞并捕获生物大分子，最大限度减少孔间污染。研究人员利用这种技术，对暴露于结核分枝杆菌的数千个人原代巨噬细胞进行测序。

细胞间互作的研究

在免疫疗法的研究中，一个重要的部分是了解生理条件下肿瘤细胞与免疫细胞之间的相互作用。在这方面，细胞捕获微流控设备可以发挥作用。操作过程是先把细胞加入正面阱中，然后引入反向流将细胞移入背面阱，并冲洗掉多余的细胞。之后再次改变流动方向将细胞移入正面阱中。最后在同一个阱中加入另一种类型的细胞，这样就能观察数百对细胞之间的静态和动态过程。人们利用这种技术检测了NK细胞与肿瘤细胞之间的相互作用。

液滴微流控技术也用于细胞间相互作用的研究。它将一对荧光染色的细胞包裹在液滴内，然后通过荧光成像进行监控。人们将T细胞与靶细胞一起包裹在液滴内，以监控其激活。在分析后，他们分选出包裹活化T细胞的液滴，然后进行下游分析，包括PCR和T细胞受体测序。这个平台能够观察T细胞与癌细胞之间的相互作用，实时分析T细胞活化动力学，并揭示T细胞异质性。

尽管细胞捕获和液滴微流控设备都可以进行高通量筛选，但它们的制造工艺复杂，且很难扩展规模。为了解决这个问题，人们也开始利用纳米孔芯片来研究细胞间的相互作用。例如，最近的一项研究利用纳米孔网格上的高通量延时成像显微镜来研究免疫细胞（T细胞和NK细胞）与靶细胞（NALM6、K562和EL4）之间的相互作用。

细胞迁移的研究

与此同时，细胞迁移也是免疫学中的一个基本过程。许多细胞迁移研究使用了微流控设备。例如，一项研究将基于膜的迁移技术整合到液滴微流控设备中。它采用膜微孔将不同的液滴连成一条链，以开展多因素的细胞迁移分析。之后通过2D/3D细胞培养、共培养和趋化剂诱导的细胞迁移，研究人员证明了这种设备的实用性。

许多趋化设备已经在2D培养条件下研究了细胞迁移，但人们还想了解3D微环境下的细胞迁移，因为细胞在生理微环境下采用不同的形态和迁移模式。之前的一项研究就开发出一种微流控设备，研究细胞在3D胶原蛋白基质中向不同浓度趋化剂迁移的效果。尽管这些设备用法简单，但它们难以扩展，通量较低。为此，研究人员又开发出高通量的微流控设备，可形成八个独立的梯度，实现高通量分析。

商业化的单细胞技术

目前，多家公司已开发出单细胞技术，可实现单细胞表型和分泌分析，包括IsoPlexis、Sphere Fluidics和Berkeley Lights。具体来说，Berkeley Lights开发的Beacon系统将细胞处理、自动化流程和深度分析相结合，可实现多种细胞分析。它利用软件来鉴定加样的细胞，然后将单细胞引导到小室中进行增殖。同时，拍摄图像以监控细胞数量或生长速率。之后开展细胞分析并鉴定感兴趣的单个细胞。最后，将这些细胞输出到孔板中进行下游分析。

Sphere Fluidics公司的Cyto-Mine设备则可以快速进行单细胞筛选、分选、分离和克隆验证，适用于抗体发现和细胞系开发。这种方法是将大约20万个单细胞包裹在液滴中，通过抗原特异性或免疫球蛋白类别进行细胞筛选，之后分选出感兴趣的细胞，将这些细胞分配到孔板中进行下游分析，如克隆扩增、PCR或测。

此外，意大利Menarini Silicon Biosystems公司还开发出一种称为DEPArray™的系统。这种技术利用电场对悬浮在溶液中的细胞施力。采用介电电泳来捕获和移动细胞，再根据高质量图像来操控和选择目标细胞。这种自动化平台可从异质样本中鉴定和回收感兴趣的单细胞。

在单细胞分选和mRNA测序方面，同样涌现出多种技术。比如，10x Genomics公司的Chromium系统和1CellBio公司的inDrop™ 系统，这两种基于液滴的技术能够对超过1万个单细胞进行高通量分选以便开展测序。Illumina和Bio-Rad联合开发的ddSEQ单细胞分离系统则将细胞与条形码包裹在液滴中。尽管这些技术已经比较成熟，但也有一些缺点，比如细胞捕获效率低、存在渗漏风险，液滴容易破碎。

为了解决这些问题，人们又开发出基于纳米孔的系统，包括BD的Rhapsody™单细胞分析系统、Takara的ICell8单细胞系统、Fluidigm的C1系统和Polaris单细胞实验系统，以及Celsee的Celselect™技术。这些技术由数千个纳米孔组成，其中大多数包含单个带条形码的微珠，可捕获单细胞mRNA进行测序。

与基于液滴的微流控技术不同，基于纳米孔的技术更加用户友好，即使是未经培训的用户也能轻松操作。另外，还可以处理少量细胞，包括稀有细胞。更重要的是，这些技术能够基于图像信息（如细胞特征、细胞形态和表面标志物）来选择感兴趣的单个细胞，从而提供单细胞的更多信息。

结语

作者认为，未来的方向之一是从灵敏度、通量、定量或多重分析能力等方面改善当前设备的性能。自动化设备的开发将简化实验操作，同时减少分析成本和时间。而那些样品处理能力高且反应试剂需求低的高通量技术的开发将极大地提高实验通量。此外，与智能手机应用或计算方法的整合则可以大大简化数据分析过程，并产生准确的结果。

现有的大多数设备都在研究2D表面上的免疫细胞反应，而忽略了天然微环境的影响。因此，她认为需要开发适用于3D环境的系统，以便研究细胞在天然微环境下如何交流、迁移和应答。未来的方向是将3D水凝胶整合到微流控设备中，有助于更好地了解体内单个免疫细胞的特征和行为。

此外，她还表示，未来的研究将向多组学分析转移，从而更全面地了解免疫系统。她认为应该开发一个简单、自动化、高通量且用户友好的平台，将mRNA测序与蛋白质、基因组和表观基因组分析相结合。同时，还可以将细胞成像整合到研究中，以便提供细胞形态、表型或活力等信息。这些综合策略将有助于人们更全面了解细胞异质性和免疫反应，促进未来的医学发展和人类健康。

参考文献

Advances in single cell technologies in immunology