蛋白快速质谱分析及潜在医学应用学术资讯

来源：X一MOL资讯

蛋白质生物标志物的快速分析，对于加速生物体系中蛋白组的鉴定以及实现蛋白质生物标志物的临床应用转化等具有重要意义。基于酶解的蛋白质质谱分析流程应用广泛，但受限于酶解反应条件的限制，样品处理所需的时间较长、条件苛刻，不适于临床分析。另外，酶解过程将在溶液基质中引入高浓度盐类。盐类离子将影响后续的质谱分析，特别是基于电喷雾电离（ESI）的质谱分析方法。

近期，清华大学欧阳证教授研究团队报道了一种基于蛋白质高温快速水解的质谱分析技术。该团队设计了基于氟聚合微管和线圈加热系统的高温微反应器（图1），将蛋白酸性溶液注入其中，快速加热至150-200 ℃下，蛋白质分子可在其内部的天冬氨酸（Asp）位点处实现快速、特异性水解。由于该过程无需引入盐及其他试剂，反应得到的包含多肽碎片的溶液可直接进行ESI或nanoESI质谱分析，在快速分析的同时实现高灵敏的结构信息解析。

图1. 高温反应器及nanoESI-MS系统用于蛋白质的快速水解和分析图示。

该研究使用人泛素蛋白（MW: 8.56 kDa）对反应原理进行验证，在150℃条件下，2分钟内即可实现泛素蛋白5个Asp位点的高效水解；并结合nanoESI-MS，快速鉴定泛素蛋白的各个水解片段。该工作进一步探索了针对含分子内二硫键的蛋白质的快速分析方法。将还原剂如二硫苏糖醇（DTT）或三(2-羧乙基)膦（TCEP）等混入蛋白的弱酸水溶液中，注入微反应器进行高温反应，5分钟内可实现肽键在Asp位点的选择性水解和二硫键的高效还原。该方法适用于高分子量蛋白质的快速分析，例如牛血清白蛋白（BSA， MW：67 kDa，含17个二硫键和40个Asp位点），采用高温水解和nanoESI-MS，可通过若干特异性多肽碎片分子得到高覆盖率的BSA多肽组成信息（图2）。

图2. 高温微反应实现BSA肽键在Asp位点的选择性水解和二硫键的快速还原。

该研究进一步探索了该方法在疾病蛋白生物标志物分析上的应用潜力。以结核杆菌抗原蛋白ESAT-6/CFP-10（MW: ~11 kDa）分析为例：ESAT-6经过高温快速水解反应得到了蛋白的特异性水解产物多肽碎片（#3）（ATATELNNALQNLARTISEAGQAMASTEGNVTGMFA，3652.75 Da），通过数据库对比证明该片段是致病结核杆菌的高特异性碎片。

这一研究成果对临床诊断的潜在意义，通过结合高温微反应器蛋白水解和小型质谱仪分析系统分析得到证明。高温水解的ESAT-6可由Mini β（清谱科技）直接分析，得到特征片段#3（图3），未来有望在医疗条件匮乏的地区（如非洲）用于结核病的现场快速诊断。

图3. 采用高温微反应器及小型质谱仪进行结核抗原ESAT-6特异性多肽的快速鉴定。

这一研究成果近期在线发表在Chemical Science 上，清华大学精密仪器仪系博士生王宇晨为第一作者，欧阳证教授、张文鹏博士为通讯作者。该工作得到了国家自然科学基金项目的资助。

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