ACS Nano：单细胞质谱揭示四膜虫对环境相关剂量纳米颗粒的摄入特征

来源：科匠学术

一、研究背景：

随着纳米科学与技术的快速发展，纳米材料在生产、使用和排放等整个生命周期进入环境。水环境中的纳米材料可被水生单细胞生物摄取，是纳米材料进入食物网的重要途径之一。研究纳米材料在单细胞水生生物体内累积，对理解纳米材料在生态环境中的迁移、转化、归趋及其生态毒理与健康效应具有重要意义。纳米材料的暴露浓度是纳米材料生物累积过程中最重要的因素之一。目前，大多的研究中纳米材料的暴露浓度比实际环境浓度高多个数量级，无法反映实际环境暴露特征。此外，细胞群体中个体间的异质性也常常被忽略，一些具有独特的生理或摄取特性的个体常常因为只能得到种群的平均值而被忽略。利用有效方法，在单细胞水平研究极低暴露浓度下纳米颗粒的累积特征和毒性效应仍然面临巨大的挑战。因此，亟需建立一种通用、灵敏、可靠的检测手段，用于单细胞中痕量金属和纳米颗粒的高通量检测。

二、文章简介：

近日，中国科学院生态环境研究中心曲广波教授团队利用质谱流式细胞仪（Mass cytometry）建立了高通量单细胞水平的痕量金属分析方法。利用该方法，曲广波教授团队以水中广泛存在的单细胞真核生物四膜虫为模式生物，探究了环境相关剂量下四膜虫对纳米金颗粒（AuNPs）的吸收和外排特征（图1）。对于AuNPs，该方法的检测限为每个细胞5.3个直径为5 nm的AuNPs。发现了即使在极低的暴露剂量下，仍然有少数四膜虫可以吞噬数百个纳米颗粒，揭示了环境相关剂量下纳米材料的生物累积风险。该研究为极低暴露剂量下金属纳米颗粒的单细胞水平生物累积与毒性效应研究提供了新方法。相关研究发表在ACS Nano上。

图1. Mass cytometry检测单个四膜虫细胞中金属纳米颗粒实验流程。

三、文章内容：

1、利用不同粒径的纳米金颗粒建立标准曲线

为了准确定量细胞中的金属，使用Mass cytometry分析了不同粒径（10-100 nm）AuNP的颗粒平均信号强度，并建立了原子个数-颗粒平均信号强度的标准曲线，根据标准曲线可以准确计算单个细胞中的金属含量（图2a）。对于单个四膜虫来说，该方法的检测限为5.3个粒径为AuNPs（直径5 nm）/四膜虫（6.67 ×10-18 g/cell），如图2b所示。

图2. (a) 10、20、50、80和100 nm AuNPs的金属强度（EIAu）的代表性直方图，(b) Au原子数-EIAu标准曲线。

2、四膜虫吸收和外排AuNPs的特征

从图2可以看到，在1 ng/mL的AuNPs暴露过程中，四膜虫主要通过主动吞噬将AuNPs快速的吸收到细胞内，在撤除暴露后四膜虫也可以快速的将AuNPs排出细胞，但仍有少量AuNPs不能被排出而累积在细胞中。另外，四膜虫表现出了很高的异质性，四膜虫对AuNPs的摄入差异可达数千个AuNPs。

图3. 1 ng/mL暴露剂量下四膜虫吸收和排出AuNPs的特征。

3、通过顺铂（195Pt）信号对四膜虫的细胞膜通透性进行同步分析

在暴露AuNPs后，使用顺铂（195Pt，不能透过完整的细胞膜）对四膜虫进行标记。根据195Pt的信号可以分析暴露过程那个四膜虫的生理状态。从图4可以看出，在整个暴露过程中四膜虫的细胞膜通透性没有明显改变，即1 ng/mL的AuNPs暴露，对四膜虫生理状态几乎没有影响。

图4.不同时间点的正常细胞（图b, PtN）百分比。

4、极低暴露剂量下四膜虫对不同粒径AuNPs的累积

如图5所示，在低至0.001 ng/mL的暴露剂量下仍然有少数四膜虫可以吞噬数百个直径为5 nm的AuNPs，吞噬有AuNPs的四膜虫个体对AuNPs的体积浓缩系数可达7000以上。相比之下，对于10或50 nm的AuNPs而言，当暴露剂量达到0.01 ng/mL时，才可观察到吞噬有AuNPs的四膜虫个体。因此，在0.001-1 ng/mL的暴露剂量下四膜虫对AuNPs累积表现了较强的尺寸依赖性。

图5. 四膜虫在极低暴露浓度下（0.001-1 ng/mL）对不同粒径的AuNPs累积。

四、总结与展望：

这项工作建立了一种高通量、高灵敏度的方法，在极低暴露剂量下，研究单细胞水平的金属纳米颗粒的生物累积和毒性效应。证明了在环境相关浓度下NPs可以被少数四膜虫累积进入食物链。在实际环境中，这些极少数个体对污染物的生物累积对整个种群的作用，以及驱动这些个体吞噬纳米颗粒的分子机制值得进一步研究。另外，该方法在研究不同类型的金属以及金属纳米颗粒复合暴露的单细胞水平毒性效应和生物累积有很好的应用前景。

五、致谢：

感谢中国国家自然科学基金（21527901、21976189、21722706），中国博士后科学基金（2018M641495），中国科学院青年创新促进会（Y7Y2142）对本项目的支持。

Authors: Qi Wu, Jianbo Shi, Xiaomeng Ji, Tian Xia, Li Zeng, Gengtan Li, Yuanyuan Wang, Jie Gao, Linlin Yao, Junjie Ma, Xiaolei Liu, Nian Liu, Ligang Hu, Bin He, Yong Liang, Guangbo Qu*, and Guibin Jiang

Title: Heterogenous Internalization of Nanoparticles at Ultra-Trace Concentration in Environmental Individual Unicellular Organisms Unveiled by Single-Cell Mass Cytometry

Published in: ACS Nano, doi: 10.1021/acsnano.0c03587.