综述：受激拉曼散射显微技术进行分子振动成像

来源：中国激光

Chinese Optics Letters 2020年第12期封面文章：

Yasuyuki Ozeki. Molecular vibrational imaging by stimulated Raman scattering microscopy: principles and applications [Invited][J]. Chinese Optics Letters, 2020, 18(12): 121702.

受激拉曼散射（Stimulated Raman Scattering, SRS）显微技术发明距今已有十二载，现已成为研究分子振动成像的强大工具。研究人员很早就想方设法去探索如何利用激光脉冲来观察生物标本，然而直到20世纪90年代才出现诸多显微技术，如多光子显微技术、三次谐波（THG）显微技术、二次谐波（SHG）显微技术以及相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）显微技术等，并且直到21世纪它们才得到广泛应用。

CARS显微技术具有可提供分子振动信息和远超自发拉曼散射显微技术的成像速度的优点，从而成为了重点研究对象。然而，CARS显微技术也存在一些缺陷，如CARS是一个涉及分子振动共振的四波混频过程，其散射信号中容易混入环境中的非共振四波混频的背景噪声。这种背景噪声不仅限制了灵敏度的提升，而且会干扰CARS使光谱失真，导致其难以被解读。因此，研究人员致力于研究如何避免CARS显微技术中存在的这些问题。

2012年，Yasuyuki Ozeki副教授所在的大阪大学K. Itoh教授课题组提出了使用SRS进行分子振动成像的想法（另外两个独立提出该想法的小组分别是：哈佛大学X. S. Xie教授课题组以及斯图加特大学A. Volkmer教授课题组）。

近日，日本东京大学Yasuyuki Ozeki副教授对SRS显微技术和多色SRS显微技术成像方法的原理以及SRS显微技术的最新应用进行了总结和展望，相关综述作为封面文章发表在Chinese Optics Letters2020年第12期上。

利用双色光脉冲观测生物分子样本振动光谱特征的受激拉曼散射显微技术所成的分子振动图像

SRS本质上是双色光与分子间的一种相互作用。当双色光（泵浦光和斯托克斯光）的频率差等于分子振动共振频率时，此时由于SRS，泵浦光强度衰减、斯托克斯光强度增强。为了在显微镜下获得SRS信号，首先需要产生同步的泵浦脉冲序列和斯托克斯脉冲序列，并且及时对斯托克斯脉冲序列进行强度调制；然后将两者结合，聚焦于同一个样本上；当SRS发生时，利用锁定检测技术获取斯托克斯脉冲序列转移到泵浦脉冲序列上的强度调制，从而可以获取SRS信号；最后，再通过扫描平台或激光焦斑，即可获得图像。

与CARS不同，SRS并不会受到非共振背景噪声的影响（虽然SRS也存在其他类型的背景噪声），因此基于SRS信号强度与分子浓度成正比的假设，很容易从SRS图像中获取信息。

在过去的10年间，SRS显微技术飞速发展。首先，各种光谱成像方法如雨后春笋般涌现，其中通过观测不同振动频率处SRS的成像可分辨分子类别；其次，各类无需标记的成像手段面世；再者，拉曼探针成像已经问世，只需将氘、炔、腈等分子标记附着于想要研究的生物分子上，即可监测和跟踪各种代谢活动，如生物分子在细胞中的掺入、生化反应和消化等，同时拉曼探针的多路成像也受到了越来越多的关注；最后，成像方式并不局限于显微技术，SRS技术已成功用于内窥镜和流式细胞仪中，这大大扩展了振动成像的应用。

尽管SRS显微技术看似已经发展成熟，但在技术方面仍然有许多问题有待解决，如功能化激光源、功能化拉曼探针、以及诸如量子光学等可提高灵敏度途径的开发。但我们相信通过光学、激光工程、量子光学、化学、生物以及医学等多学科的共同力量，假以时日定可将SRS用于生物医学成像领域。