磷酸化修饰组学揭示雷帕霉素治疗Leigh氏综合征的关键分子作用机制

来源：精准医学与蛋白组学

一、雷帕霉素影响Ndufs4 (-/-) 小鼠大脑蛋白质含量

利用出生后30天的野生型 (WT)、Ndufs4 (-/-) (KO) 及经雷帕霉素治疗的Ndufs4 (-/-) (KR) 小鼠大脑（样本策略），研究人员共定量检测到6,231种蛋白质，其中1,004种 (16%) 蛋白质的含量在各组间出现显著改变。在KO组中，NDUFS4的缺失导致了大量线粒体蛋白质含量的明显减低，包括大多数C-I蛋白质 (除了ACAD9和NDUFAF2) ；而其他线粒体呼吸链复合体物，比如细胞色素C氧化酶的含量则在整体上有所升高。雷帕霉素治疗 (KR) 除了逆转上述蛋白质含量改变外，还明显降低了mTOR复合物的核心亚基mTOR和mLST8的含量；更为重要的是，常见的三种PKC亚型 (PKC-α, PKC-β and PKC-γ) 的蛋白质含量也在KR组中明显减低，暗示雷帕霉素可能抑制PKC活性。

图1  NDUFS4缺失对小鼠大脑蛋白质含量的影响

二、雷帕霉素抑制Ndufs4 (-/-) 小鼠大脑PKC活性

考虑到mTOR的激酶本质，研究人员推测雷帕霉素对mTOR含量的改变会影响Ndufs4 (-/-) 小鼠大脑蛋白质的磷酸化修饰水平。利用磷酸化修饰组学（质谱策略），作者们定量检测到了15,971个磷酸化修饰位点，约26%的位点是首次报道。在KO组中，NDUFS4的缺失只引起了少数激酶含量的变化，所以整体上并没有明显改变蛋白质磷酸化修饰水平。与此不同的是，雷帕霉素治疗 (KR) 则使得Ndufs4 (-/-) 小鼠大脑蛋白质的磷酸化修饰水平出现了显著改变，其中，多种mTOR复合物亚基、mTOR信号作用底物以及PKC的磷酸化水平都出现了明显下调。随后，通过激酶-底物富集分析 (kinase–substrate enrichment analysis, KSEA)，研究人员发现KR组中的PKC-β活性显著降低。不仅如此， KR组中，许多参与细胞内Ca2+稳态调节的蛋白质功能都受到了抑制，如ITPR1 基因编码的内质网Ca2+释放通道1,4,5-三磷酸肌醇受体的蛋白质含量及磷酸化修饰水平都显著降低。由于PKC亚型 (PKC-α, PKC-β and PKC-γ) 的激活多依赖Ca2+，以上这些证据共同表明，雷帕霉素治疗后的Ndufs4 (-/-) 小鼠大脑中，PKC活性受到了抑制。

图2  雷帕霉素对Ndufs4 (-/-) 小鼠大脑PKC活性的抑制作用

三、雷帕霉素通过抑制PKC活性缓解Ndufs4 (-/-) 小鼠LS症状

倘若雷帕霉素是通过下调PKC活性以治疗线粒体疾病，那么理论上，PKC特异性抑制剂也可以起到相似的治疗效果。已有研究表明，Ndufs4 (-/-) 小鼠由于异常激活的皮肤炎症反应会引起大量毛发脱落，这种现象在一定程度上能够被雷帕霉素所缓解。值得注意的是，研究人员发现广谱PKC抑制剂 (GO6983 和GF109203X) 以及PKC-β特异性抑制剂ruboxistaurin都比雷帕霉素更好地改善了Ndufs4 (-/-) 小鼠的毛发脱落现象。不仅如此，三种PKC抑制剂都明显了延长了Ndufs4 (-/-) 小鼠寿命、延缓了神经功能障碍发病时间，同时，ruboxistaurin对Ndufs4 (-/-) 小鼠神经炎症反应的治疗效果也最为明显。

图3  PKC抑制剂对Ndufs4 (-/-) 小鼠的治疗作用

本文中，蛋白质组学、磷酸化修饰组学数据在帮助研究人员系统了解Ndufs4 (-/-) 小鼠大脑蛋白质功能改变的基础上，也为阐明雷帕霉素治疗线粒体疾病的分子机制提供了有说服力的证据支持。更为重要的是，雷帕霉素药物靶点PKC的发现，或将为Leigh综合征等罕见线粒体疾病的明确诊断、精准治疗提供崭新思路。

磷酸化修饰组学

磷酸化修饰（phosphorylation）发生在细胞内超过30%的蛋白质上，是调节和控制蛋白质活力和功能的最基本、最普遍、也是最重要的机制。磷酸化参与各种生理和病理过程，调控细胞的增殖、发育、分化、凋亡等生命活动，广泛运用在信号通路转导、细胞凋亡、发育分化、癌症机理等研究领域。

景杰生物率先推出高深度磷酸化修饰定量分析，使用专有抗体靶向富集磷酸化修饰肽段，降低样本复杂性；结合严格的双重质控和生信分析，强强联合，广泛应用在生理病理下磷酸化机制研究。