研究进展 | 早期肺癌患者呼出气特征性挥发性有机化合物及其诊断价值研究学术资讯

来源：中华医学会胸心分会

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关键词：肺癌；早期诊断；呼出气；挥发性有机化合物；诊断模型

引用本文：彭晓琴，刘明心，戴维，谢少华，向润，张峰懿，李强. 早期肺癌患者呼出气特征性挥发性有机化合物及其诊断价值研究. 中国胸心血管外科临床杂志, 2020, 27(12):1249-1435. doi: 10.7507/1007-4848.202003019

摘要

目的　研究早期肺癌患者呼出气特征性挥发性有机化合物（volatile organic compounds，VOCs）及其诊断价值。

方法　应用固相微萃取联合气相色谱质谱技术分析 117 例早期肺癌患者［男 54 例、女 63 例，年龄

（61.9±6.8）岁］和 130 例健康受试者［男 79 例、女 51 例，年龄（63.3±6.6）岁］呼出气中 VOCs，筛选早期肺癌特征性 VOCs，建立诊断模型。

结果　筛选出乙酸、正丁醇、二甲基硅醇、甲苯、2,3,4-三甲基庚烷、3,4-二甲基苯甲酸、5-甲基-3-己烯-2-酮、正己醇、2-氧代戊二酸甲酯和 4-甲氧基苯酚共 10 种早期肺癌特征性 VOCs。将性别及 10 种早期肺癌特征性 VOCs 纳入诊断模型，其敏感性为 83.8%，特异性为 96.2%。

结论　呼出气 VOCs 有望成为早期肺癌的潜在诊断方式之一。

正文

肺癌是目前发病率和死亡率最高的恶性肿瘤[1]。据统计，肺癌的 5 年生存率（overall survival， OS）为 10%～20%[2]，其中 Ⅰ A1 期非小细胞肺癌的 5 年 OS 可达 92%，而 Ⅳ A 期非小细胞肺癌的 5 年 OS 仅为 10%[3]。可见，肺癌的早期诊断至关重要。目前临床常用的肺癌早期筛查手段仍存在辐射危害[4]、有创[5]、费用高等不足，因此寻找一种新型肺癌筛查方法至关重要。挥发性有机化合物（volatile organic compounds，VOCs）由肿瘤细胞及其相关代谢过程产生，并通过肺、皮肤等排出体外[6]。因此，可通过分析呼出气 VOCs 成分和丰度的改变来评估机体健康状态和疾病类型[7]。与传统肺癌诊断方法相比，呼出气检测具有简单、无创等优点，且能相对更早地检测出疾病[8]。因此，呼出气检测逐渐成为最具潜力的肺癌诊断手段之一[9]。

早期肺癌的诊断成为临床的热点和难点，目前尚未见专门针对早期肺癌 VOCs 标志物的研究。本研究将纳入早期肺癌患者和健康受试者，采用固相微萃取（solid-phase micro-extraction，SPME）联合气相色谱质谱分析技术（gas chromatography mass spectrometry，GCMS）分析受试者呼出气 VOCs，从中筛选出早期肺癌特征性 VOCs 并建立诊断模型。

1 资料与方法

1.1 临床资料和分组

采集 2018 年 4～12 月于四川省肿瘤医院就诊的 524 例胸部 CT 异常患者的呼出气。纳入标准：（1）年龄 50～74 岁，性别不限；（2）肺原发病灶最大径≤ 3 cm；（3）行手术治疗，术后病理为原发性肺癌，病理分期为 0～ⅠB 期；（4）签署知情同意书。排除标准：（1）既往有恶性肿瘤病史；（2）合并支气管哮喘、重症肝功能损害、终末期肾病、炎症急性期和糖尿病。最终 117 例肺癌受试者纳入该研究作为肺癌组。

采集成都市龙泉驿区疾病预防控制中心和南充市中心医院两个肺癌筛查点 644 例健康受试者的呼出气。纳入标准：（1）年龄 50～74 岁，性别不限；（2）行 CT 筛查排除肺癌；（3）签署知情同意书。排除标准与肺癌组相同。随机抽取 130 例健康受试者纳入该研究作为对照组。

1.2 试剂与仪器

有机化合物标准样品购自上海阿拉丁试剂有限公司；500 mL-Tedlar 采气袋购自大连德霖气体包装有限公司；SPME 手柄（57330-U）和 CAR/ PDMS/DVB 萃取纤维针购自 Sigma-Aldrich 公司；GCMS 联用购自赛默飞世尔科技有限公司。

1.3 呼出气采集与分析

所有受试者采气前禁食、禁烟 12 h，早晨空腹采集，并在同一环境下（通风室内）进行。呼出气为未经剧烈运动、平静时呼出的气体，通过一次性纸口件向 Bio-VOC 针筒中缓慢吹气，直到肺部气被全部排出为止，期间不能进行 2 次呼吸。然后操作者通过针筒推杆将采集到的肺泡气转移至 Tedlar气袋中，如此重复取 3 次呼出气完成一个样本收集。采样点的环境空气也被平行收集，用于背景矫正。因呼出气中 VOCs 浓度通常在 nmol～pmol 之间[10]，因此需要根据目标检测物的性质，选择相应的混合型纤维头进行 SPME，再进入气相色谱质谱仪进行分析。将存在于至少 70% 受试者呼出气中的 VOCs 定义为内源性物质。

1.4 统计学分析

采用 SPSS 23.0 软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差（）表示，组间比较采用 t检验或 Mann-Whitney U检验，计数资料以频数或百分比表示，组间比较采用卡方检验。肺癌特征性 VOCs 筛选通过绘制受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线，并计算 ROC 曲线下面积（area under the curve，AUC），选取标准为 AUC>0.7 且 P<0.05。利用二元 logistic 回归分析建立诊断模型。检验水准 α=0.05。

1.5 伦理审查与临床试验注册

本研究已通过四川省肿瘤医院伦理委员会审批，批准号：SCCHEC-02-2017-011，且在中国临床试验注册中心注册，注册号：ChiCTR -DOD -17011134。

2 结果

2.1 一般资料比较

肺癌病理类型以腺癌为主，占 86.3%。肺癌组与对照组在年龄、性别和吸烟情况等方面差异有统计学意义（P<0.05）；见表 1。

表1　两组受试者一般资料（例/）

*：吸烟指数≤ 200 为轻度吸烟，200～400 为中度吸烟，≥ 400为重度吸烟；吸烟指数=每天吸烟支数×吸烟年数

2.2 两组受试者呼出气 VOCs 比较

本研究筛选出 30 种内源性 VOCs，其中定性分析筛选出乙酸等 15 种差异有统计学意义的物质；见表 2。再对剩余 15 种 VOCs 进行定量分析，筛选出差异有统计学意义的 12 种 VOCs；见表 3。

表2　两组受试者 VOCs 检出率比较（%）

VOCs：挥发性有机化合物

表3　两组受试者 VOCs 定量比较

2.3 VOCs 的 ROC 曲线分析

采用 ROC 曲线法提取早期肺癌特征性 VOCs，筛选 AUC>0.7 且 P<0.05 的 VOCs 作为肺癌特征性标志物，并绘制 ROC 曲线。筛选出乙酸、正丁醇、二甲基硅醇、甲苯、2,3,4-三甲基庚烷、3,4-二甲基苯甲酸、5-甲基-3-己烯-2-酮、正己醇、2-氧代戊二酸甲酯和 4-甲氧基苯酚共 10 种 VOCs；见图 1。其中，乙酸、正丁醇、二甲基硅醇、甲苯、5-甲基-3-己烯-2-酮、正己醇、2-氧代戊二酸甲酯在对照组的表达高于肺癌组，而 2,3,4-三甲基庚烷、3,4-二甲基苯甲酸、4-甲氧基苯酚在肺癌组的表达高于对照组。

图1　10 种早期肺癌特征性 VOCs 的 ROC 曲线

2.4 肺癌受试者一般临床特征与各特征性 VOCs的关系

2.4.1 性别

为明确早期肺癌 VOCs 标志物在不同性别表达有无差异，绘制 10 种早期肺癌 VOCs 的 ROC 曲线，并计算各自的 AUC。甲苯（AUC= 0.778）、正丁醇（AUC=0.727）、2-氧代戊二酸甲酯（AUC=0.757）在男性受试者中的表达高于女性（P均<0.05）。

2.4.2 年龄

将年龄分为 50～59 岁、60～69 岁和 70～74 岁 3 组。绘制 10 种肺癌 VOCs 标志物在不同年龄段的 ROC 曲线，并计算各自的 AUC。结果 AUC 均<0.6 且差异无统计学意义（P均>0.05）。

2.4.3 吸烟状态

117 例肺癌患者中，轻度、中度吸烟各 2 例，故比较重度吸烟、已戒烟、不吸烟患者的差异，绘制 ROC 曲线，并计算各自的 AUC。甲苯（AUC=0.771）在重度吸烟受试者中高于已戒烟和不吸烟受试者（P<0.05）。

2.5 建立诊断模型

将年龄、性别、吸烟状况及 10 种特征性 VOCs利用有条件向前的方法纳入模型，建立二元 logistic回归模型，回归方程为：logit（P）=4.493.3.876X1 .0.252X2.0.534X3.0.086X4.0.014X5+0.146X6.0.230X7 +0.256X8.0.030X9；见表 4。以 0.7 作为分类分界值，利用该诊断模型预测受试者的患病情况与金标准对比，计算出该模型的敏感性 83.8%，特异性 96.2%。

表4　logistic 回归方程中的变量

3 讨论

本研究筛选出的 10 种 VOCs，只有正丁醇和甲苯在既往文献报道中出现了 3 次以上[11]，其它 VOCs 均与既往研究不同。据报道[11]，苯及其衍生物、烷烃和醛类是肺癌患者中最常见的 3 类 VOCs。Phillips 等[12]报道的肺癌特征性 VOCs 主要是烷烃类及其衍生物和苯衍生物。胡燕婕[13]报道的肺癌特征性 VOCs 大多为 C10 以上的烷烃。目前国内外对于呼吸气 VOCs 成分的报道存在差异，分析其主要原因有：（1）肺癌病理生理的复杂性及人体 VOCs 产生机制的不明确性；（2）气体采样差异，包括呼吸流量差异[14]、气体采样方法不同、采样装置的多样性和气体采集体积差异等[15]；（3）气体采集到分析间隔时间不同[16]；（4）预浓缩方法不同，即使采用同一种预浓缩技术，选择不同的吸附剂均有可能造成气体样品 VOCs 成分失真；（5）气体样本检测设备不同，对 VOCs 成分检测的敏感性存在差异；（6）数据分析方法不同，例如 Phillips 等[12]在 2007 年文章中采用模糊逻辑的统计学方法得出 16 种 VOCs，而对同一组数据采用多元线性回归得出 11 种 VOCs；（7）研究对象不同，本研究仅入组了早期肺癌患者，与既往研究不同。因此，当呼出气的采集方式、富集方式、检测方式和数据处理方式等还没有统一标准时，肺癌呼吸气特征性 VOCs成分难以实现一致性。

事实上，目前还没有一种 VOCs 被发现只存在于肺癌患者的呼出气中[17]。本研究筛选出的 10 种特征性 VOCs，在肺癌组及对照组均有表达，其中乙酸、正丁醇、二甲基硅醇、甲苯、5-甲基-3-己烯-2-酮、正己醇、2-氧代戊二酸甲酯在对照组的表达高于肺癌组。Phillips 等[12]同样发现大多数 VOCs 的丰度在肺癌患者中降低。Bajtarevic 等[18]发现健康人呼出气中异戊二烯、丙酮和甲醇的浓度高于肺癌患者。分析原因可能是肺癌患者中，氧化应激产生的 VOCs 被高度可诱导的细胞色素 P450 混合氧化酶分解代谢[19]，从而降低了它们的丰度。

本研究结果提示甲苯、正丁醇、2-氧代戊二酸甲酯在男性受试者中的表达高于女性，差异有统计学意义。而另有文献[20-21]报道性别对 VOCs 成分谱没有影响。上述文献中样本量均较小，而本研究入组样本量大，但性别在两组受试者中匹配度差，男性明显多于女性，且吸烟者多为男性，而既往研究提示苯释放与吸烟有关，故可能导致结果偏倚。

本研究显示 50～59 岁、60～69 岁和 70～74 岁3 个年龄组间呼出气 VOCs 表达差异无统计学意义。Dragonieri 等[22]发现<45 岁与>45 岁两个年龄组之间呼出气中 VOCs 差异没有统计学意义。Mazzone 等[20]发现年龄对所建立的肺癌预测模型没有影响。然而，Phillips 等[23]发现青年组（9～31 岁）与老年组（74～89 岁）健康个体呼出气 VOCs 存在显著差异。由于既往研究多停留在对不同年龄正常人群呼出气的比较，虽有关于肺癌患者呼出气 VOCs 在不同年龄的研究，但均为小样本研究。本研究对象为早期肺癌患者，且年龄跨度小，这可能导致不能得出阳性结果，因此要明确早期肺癌特征性 VOCs 在不同年龄表达情况，需要更进一步研究。

既往研究[24]认为吸烟能影响呼出气 VOCs 成分谱，因烟草烟雾中含有大量的 VOCs，它通过增加氧化应激和脂质过氧化来改变与 VOCs 产生相关的细胞过程。Capone 等[25]发现与不吸烟的肺癌患者相比，吸烟者呼出气中的苯、甲苯和 2,5-二甲基呋喃增加。Alonso 等[26]发现甲苯和二甲苯在重度吸烟者呼出气中含量更高。本研究结果显示，甲苯在重度吸烟者中的表达明显高于已戒烟者及否认吸烟者，差异有统计学意义，与既往研究基本一致。

目前常用肺癌早筛方式为低剂量螺旋 CT，其存在假阳性率高[27]、过度诊断、过度治疗[28]和辐射危害[4]等不足。因此寻找一种新型肺癌筛查方式至关重要。呼出气分析具有安全、无创、可重复性等优点。本研究基于呼出气建立的早期肺癌诊断模型灵敏性达 83.8%，特异性达 96.2%，与既往呼出气 VOCs 鉴定肺癌研究[29-30]的结果大致相似。本研究通过经典的 Tedlar 袋呼出气采集、GCMS 化学分析及多重数据分析模式建立了早期肺癌呼出气的诊断模型，是国际基于早期肺癌呼出气检测的较大样本研究，其结果表明：呼出气 VOCs 有望成为早期肺癌的潜在诊断方式之一。

该研究存在的局限性包括：（1）年龄分布局限，入组受试者年龄 50～74 岁，而肺癌实际发病年龄有下降趋势；（2）两组受试者的年龄、性别和吸烟状态分布不均，可能对结论有一定影响；（3）纳入临床特征少，本研究仅纳入了性别、年龄、吸烟状态，而饮酒、合并症等其它混杂因素均未做进一步研究；（4）GCMS 是呼出气分析的经典方法，但是其检测 VOCs 的种类和精度仍有限[18]；（5）本研究只是建立了初步的诊断模型，尚需要进一步进行验证性研究。

利益冲突：无。

作者贡献：彭晓琴负责论文设计，实施研究，数据采集、分析与解释，论文初稿撰写；刘明心负责论文设计、实施研究、数据采集；戴维负责论文设计、数据采集、对文章知识性内容作批判性审阅；谢少华负责实施研究、采集数据；张峰懿负责对文章知识性内容作批判性审阅；向润负责采集数据；李强负责论文设计、对文章知识性内容作批判性审阅。

参考文献略。

作者简介

通信作者：李强

主任医师/教授/博士生导师

四川省肿瘤医院胸外科中心主任

享受国务院特殊津贴专家

中华医学会胸心外科分会委员

中国医师协会胸外科分会常务委员

中国抗癌协会肺癌专业委员会常务委员

四川省突贡专家

四川省医学会心胸外科专业委员会候任主任委员

四川省抗癌协会第六届常务理事会常务理事