胞外囊泡糖基化修饰的双选择磁响应性解析

来源：X一MOL资讯

胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）是一类由细胞分泌到胞外的能够被受体细胞摄取的膜性囊泡小体，直径在20～1,000 nm。作为近年来的研究热点，胞外囊泡被证实在疾病诊断、预后评估以及药物递送等方面具有重要的生物学作用。作为细胞间信息的传递以及物质的运输媒介，胞外囊泡携带多种生物学物质，如核酸、蛋白质、脂分子等。近来研究表明，胞外囊泡是被糖基化修饰的，其表面覆盖了大量的聚糖以及糖结合蛋白。鉴于聚糖类物质在调控细胞黏附、细胞-细胞之间的信息传递、细胞和细胞外基质相互作用、免疫调节和肿瘤转移等方面发挥重要的作用，胞外囊泡糖基化修饰的有效分析对于揭示聚糖在胞外囊泡的合成、释放以及运输过程及其生物学功能中的作用具有重要意义。不同于核酸和蛋白质等这些已被深入研究的生物学分子，胞外囊泡的聚糖分子分析因其结构和组成的复杂性而面临极大挑战。现有的分析手段如质谱和凝集素微阵列等虽然实现了聚糖的综合性通量分析，但仍旧面临复杂的样品处理过程、样品量消耗大、检测灵敏度低等诸多问题。

近期，新加坡国立大学邵慧琳（Huilin Shao）教授团队针对胞外囊泡糖基化修饰分析难题，开发了一种巨磁阻（GMR）微流控分析检测平台iMAGE。该平台结合了多磁核磁性纳米探针、巨磁阻检测和微流控器件三者优势，克服了已有分析手段耗时长、分析过程繁琐、检测灵敏度低等问题，实现了胞外囊泡聚糖分子的微量、快速、简便且灵敏的实时检测。该成果提供了一种新型的胞外囊泡糖基化修饰分析检测手段，有望在新型胞外囊泡生物标志物发现、疾病诊疗、预后评估及糖组学等领域发挥重要作用。相关论文发表于Cell Press 旗下的材料科学旗舰期刊Matter，第一作者为博士后王志刚和孙学成。

图1. iMAGE检测平台的结构设计和胞外囊泡糖基化修饰分析流程以及多磁核纳米探针捕获胞外囊泡TEM表征。图片来源：Matter

iMAGE分析流程包括三步：首先多磁核磁性纳米探针对胞外囊泡进行捕获标记，然后溶液中加入多价态凝集素（lectin）分子，基于凝集素与不同胞外囊泡上聚糖的亲和性结合，磁性探针标记的胞外囊泡（PMP-EVs）将聚集成大粒径的磁响应性颗粒，在外加磁场的作用下，大粒径的磁性聚集体将被捕获在平台底部，而未被捕获的小粒径磁性探针将被导入GMR检测区域，最后针对样品上清液磁性探针的GMR信号进行检测（图1）。该平台可以置于特殊设计的检测装置，同时进行四通道检测，实现快速高通量分析。

图2. 磁性多核纳米探针的表面结构设计优化及其对胞外囊泡的快速高效捕获标记，以及凝集素诱导磁性探针标记的胞外囊泡聚集进而影响巨磁阻检测信号强度分析。图片来源：Matter

针对磁性探针表面性质的优化实验表明不同的功能性外壳具有截然不同的捕获标记效率。其中聚多巴胺（PDA）具有最高的标记效率，这应该得益于PDA与胞外囊泡表面分子如蛋白质的多重相互作用。对于不同浓度的单一胞外囊泡样品，PDA磁性纳米探针均可以快速有效地捕获标记溶液中的胞外囊泡（< 5 min）。磁性纳米探针对胞外囊泡的有效标记，凝集素及其对应亲和的多糖链是形成磁性聚集体的前提条件。而且胞外囊泡浓度越高，磁性聚集体的粒径越大，相应的GMR信号越强（图2）。

图3. 磁性多核纳米探针对胞外囊泡的双选择性捕获标记，以及iMAGE平台分析检测灵敏度和可靠性考察。图片来源：Matter

凝集素诱导的PMP-EVs聚集表现出双选择性（图3）。选择性一为对于不同尺寸的磁性探针，与胞外囊泡物理尺寸接近的磁性探针表现出最佳PMP-EVs聚集行为；选择性二为相同条件下，胞外囊泡样品的PMP-EVs聚集效应要远强于小尺寸的糖基化蛋白分子样品，这应该得益于胞外囊泡表面丰富的聚糖链的存在增加了凝集素与胞外囊泡的结合机会进而增强了相应的PMP-EVs聚集效应。iMAGE表现出优异的检测性能，其检测限（104 EVs）是传统检测金标准方法ELISA（107 EVs）的将近1,000倍，同时其可靠性也媲美于ELISA。

图4. iMAGE平台对不同细胞来源的胞外囊泡糖基化修饰的通量分析。图片来源：Matter

基于iMAGE检测平台，作者应用21种靶向不同聚糖结构的凝集素对不同细胞来源的胞外囊泡糖基化修饰进行通量分析，结果表明不同细胞来源的胞外囊泡的某些糖基化修饰具有保守性（如RCA120, WGA），而其他的糖基化修饰则表现出不同的细胞系差异性（图4）。

图5. iMAGE平台对临床样本的胞外囊泡糖基化修饰的通量分析。图片来源：Matter

为了实现iMAGE对复杂生物样品中胞外囊泡糖基化修饰的有效分析，磁性纳米探针表面预先修饰了靶向胞外囊泡特定标识物的抗体（Anti-CD63 mAb、Anti-CD24 mAb）（图5A）。这些表面携带抗体的磁探针可以快速简便的从复杂的生物样品中选择性捕获胞外囊泡，从而极大的提高了检测信号，表现出远优于ELISA的分析性能（图5B）。为了进一步考察iMAGE平台在真实临床样本中的应用潜力，作者应用iMAGE针对结直肠癌和胃癌病人的腹腔积液中胞外囊泡糖基化修饰进行通量分析（图5C），结果揭示了腹腔积液中胞外囊泡不同的糖基化修饰差异性表达。更为重要的是，某些糖基化修饰（包括Jacalin、ConA、RCA120、PHA-E、STA、LEL、WGA、DSL）在不同的样本组中表现出明显差异，其中治疗效果良好样品组信号强度低，而治疗效果差的样品信号较强，说明这些特定的糖基化修饰具备作为预后诊断生物标志物的潜力，从而有助于判定疾病治疗效果。

小结

该工作基于多磁核纳米探针的优异的磁响应性，结合巨磁阻检测的高灵敏度和微流控器件的高通量分析等优势，提出了一种新型检测平台iMAGE，将聚糖信息转换为磁信号，实现了对胞外囊泡糖基化修饰双选择性的快速简便高效的实时通量分析。该平台不仅揭示了不同胞外囊泡的差异性糖基化修饰，而且其对临床样本的分析表明某些胞外囊泡糖基化修饰表达与疾病治疗效果趋势表现出一致性。该平台有望促进新型胞外囊泡糖基生物标志物发现，非侵入性疾病诊疗及预后评估，糖组学分析，新型生物学检测技术开发等诸多领域的进一步发展。