周琪/李伟/海棠合作团队首次获得猴-猪嵌合活体

来源：BioArt

撰文 | 雪月

责编丨迦溆

器官移植是治疗器官衰竭病人最有效的手段，但目前中国人体器官捐献的供需仅有1：30。运筹学与管理科学研究协会发表在 INFORMS （The Institute for Operations Research and the Management Sciences）的一项研究指出，全世界每天有18人在等待移植中死亡，每10分钟就有一名新病人加入器官移植名单。通过多能干细胞进行异种嵌合被认为是有可能在动物体内获得人类器官的方法，期许能够补充器官移植的巨大需求以及解决移植排斥问题【1】。2010年大鼠器官在小鼠胚胎内成功构建。利用大鼠的多能干细胞 (pluripotent stem cells， PSC) 与PDX-1缺陷（pancreatic and duodenal homeobox-1 deficient）的小鼠胚胎形成嵌合体则能够得到具有正常生理功能的大鼠胰腺【2】。类似的研究也可以从裸鼠中得到大鼠的胸腺组织。

自20世纪70年代以来，世界各国的科学家们一直在以异种嵌合体，如绵羊-山羊嵌合体、大鼠-小鼠嵌合体等回答一些基础发育生物学问题。目前小鼠是主要的嵌合宿主，但是由于啮齿动物和人之间的胚胎大小和妊娠期区别过大，需要寻找其他更为合适的嵌合宿主。Juan Carlos Izpisúa Belmonte带领的团队首次在大型动物中实现了嵌合研究【1】。该团队成功的将hPSC整合到猪的胚泡中，成功实现了hPSC在早期猪胚胎中存活。但近年来多项研究结果表明人类胚胎干细胞在大动物胚胎内的嵌合难度大，仍需要解决大量的基础科学问题，且相关的伦理问题阻止了人类嵌合体在胚胎后期的研究。灵长类PSC具有与hPSC相似的多能分化能力，是很好的研究嵌合体形成器官的模型。非人灵长类动物的异种嵌合体也是研究疾病、生长发育以及器官移植的潜在模型。有研究发现食蟹猴来源的PSC也可以在最佳的培养条件下存活于嵌合体中。

近日，中国科学院中国科学院动物研究所和中国科学院干细胞与再生医学创新研究院周琪、李伟和海棠课题组（助理研究员付锐、余大为、博士生任吉龙、李崇阳为共同第一作者）在Protein Cell杂志上发表了题为Domesticated cynomolgus monkey embryonic stem cells allow the generation of neonatal interspecies chimeric pigs的文章。研究团队评估了食蟹猴胚胎干细胞在猪中的嵌合能力，通过优化其培养和嵌合系统，增强食蟹猴胚胎干细胞的抗凋亡能力，改善嵌合胚胎的发育，最终获得了两个食蟹猴-猪嵌合体。

作者首先筛选用于嵌合体的最佳食蟹猴PSC（cmPSC）。作者培养了三种：起始期 PSC（primed，有研究表明这个阶段的PSC已经能够参与器官形成）【3】，中间阶段期PSC（intermediate）， 原始期PSC（naive），并且用GFP标记这些细胞。每组取十个进行评估发现中间阶段期PSC生存能力好，凋亡水平低，融入猪胚胎内细胞团能力较强。但是在体内评估阶段，将1203个胚泡植入母猪体内，胚泡无一例存活。作者称体外培养的24小时或许造成了严重损害。即使在cmESC内过表达抗凋亡蛋白BCL2L1能够降低ESC凋亡率，却也未能得到存活的胚胎。为了减少体外培养带来的损伤，作者对比了细胞培养基和胚胎培养基的pH和渗透压，猜测可能是这些不同导致了体外培养损伤，于是作者将两种培养基以1:1混合，使细胞培养基更接近于胚胎培养基。作者将这种培养基称为domestic medium（DM），用DM培养的cmESC称为D-ESCs，检测发现这种培养方法极大的改善了嵌合体中ESC以及胚胎的存活。进一步检测存活的胚胎中一些标志物发现D-ESCs能够分化成三胚层，形成嵌合胚胎。为了评估长期效果，作者将超过4000个胚胎植入母猪中，最后共有三只怀孕的母猪，其中一只自然流产，另外两只共产下10只幼崽。但所有的幼崽在一周内全部死亡了。十只幼崽的多种器官进行了进一步实验发现，有两只为嵌合小猪仔。带有GFP的食蟹猴细胞分布在包括心脏、肝脏、脾、肺、皮肤在内的多种器官，嵌合细胞比例为0.001–0.0001。但是在睾丸和卵巢中没有食蟹猴细胞。检测细胞标志物表明嵌入的食蟹猴细胞是已经分化成熟的细胞，不具有多分化能力。这些数据表明该课题组成功生产了食蟹猴和宿主猪之间嵌合体。

此项研究首次实现了灵长类和猪嵌合体的活体出生，推进了异种嵌合体器官再造过程，提供了一个研究异种器官再生的可行思路，并为实现大型嵌合体动物体内器官重建的最终目标架桥铺路。

外媒"NewScientist"于12月6日重点报道了这项研究，并给与了高度评价：由中国的一个研究课题组构建了灵长类食蟹猴和猪的嵌合体，并成功出生，这是猪灵长类嵌合体首次出生存活，虽然它们都在一周内死亡。

该课题组的海棠称因为非嵌合体猪也在一周内死亡，他们猜测嵌合体死亡的原因并非与嵌合体有关，也为日后更新方法提供了佐证。

值得一提的是，截止到发稿前，发表在Protein & Cell杂志上的这项工作在发表不到两周的情况下，目前的论文下载量超过了3700次，被外媒和推特等报道转发的次数也达到了64次（下图），具有较大的国际影响力。

原文链接：

https://link.springer.com/article/10.1007/s13238-019-00676-8

参考文献

1. Wu J, Platero-Luengo A, Sakurai M, Sugawara A, Gil MA, Yamauchi T et al. Interspecies Chimerism with Mammalian Pluripotent Stem Cells. Cell 2017; 168(3): 473-486 e415; doi 10.1016/j.cell.2016.12.036.

2. Kobayashi T, Yamaguchi T, Hamanaka S, Kato-Itoh M, Yamazaki Y, Ibata M et al. Generation of rat pancreas in mouse by interspecific blastocyst injection of pluripotent stem cells. Cell 2010; 142(5): 787-799; doi 10.1016/j.cell.2010.07.039.

3. Wu J, Okamura D, Li M, Suzuki K, Luo C, Ma L et al. An alternative pluripotent state confers interspecies chimaeric competency. Nature 2015; 521(7552): 316-321; doi 10.1038/nature14413.