中国医科院血液研究所张孝兵/程涛团队使编辑效率提高10至20倍学术资讯

来源：iNature

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A型血友病是由F8突变引起的出血性疾病，只能通过基因疗法治愈。有研究表明CRISPR-Cas9介导的F8在肝细胞中高表达基因位点（如白蛋白（Alb））的精确插入。不幸的是，对于较长的插入物的精确体内整合效率非常低（〜0.1％）。

2019年12月16号，中国医科院血液研究所张孝兵、程涛团队在Genome Biology上在线发表了题为Curing hemophilia A by NHEJ-mediated ectopic F8 insertion in the mouse的研究论文。该研究为在AAV介导的编辑成分递送后，通过NHEJ敲除BDDF8在Alb内含子上治愈A型血友病奠定了基础。

甲型血友病（HA）是最常见的遗传疾病之一，在美国，每5000例男性出生中就有1例发生，占所有血友病病例的约85％。 HA是由X染色体上的凝血因子VIII（F8）基因突变引起的。重组F8已被广泛用于治疗HA，但这已导致20–30％的患者产生抑制性抗体，限制了治疗效果。

由于F9蛋白长度较短(461个氨基酸)，以腺相关病毒(AAV)为基础的基因治疗在治疗血友病B(F9突变)方面取得了重大进展。输注AAV表达因子IX Padua(F9-R338L)已实现了活性F9蛋白的持续表达。然而，由于AAV的包装限制，血友病A基因治疗的进展相对滞后。F8蛋白全长2332个氨基酸长，但B区大部分缺失使其大小减少38%。

因此，研究者已经在基因治疗研究中使用了B结构域缺失的F8(BDDF 8)。在注射大剂量BDDF 8编码AAV 5对AAV的免疫反应后，多名成人患者在长达1年的时间内获得了相对稳定的血清F8活性。尽管有很好的结果，但长期的安全性和有效性仍有待确定，因为肝细胞的周转将导致AAV的逐渐消失，尽管在成人中进展缓慢。重新使用相同的载体是挑战的结果，因为AAV中和抗体激发的最初治疗。出于同样的原因，非整合的AAV治疗不适用于儿童患者.在这里，研究人员试图开发一种疗法，可以使所有年龄层的患者受益，使用基因组编辑方法。

在这里，研究报告，使双重切割供体可使肝脏编辑效率提高10至20倍，从而在小鼠血友病A模型中完全重建血清F8活性，并在血液中注射Cas9-sgAlb和B结构域缺失(Bdd)F8供体质粒后进行。研究发现，小鼠肝脏Alb位点上的双重供体的整合主要是通过非同源端连接(NHEJ)介导的基因敲入。研究人员将BDDF 8靶向到内含子11和13的多个位点，发现NHEJ介导的BDDF 8的插入恢复了止血作用。最后，使用3个AAV 8载体，包括Cas9、sgRNA和BDDF 8供体来传递基因组编辑成分，观察到同样的治疗效果。对100只一年以上的小鼠进行随访，无不良反应.这些发现为在AAV介导的编辑成分递送后，通过NHEJ敲除BDDF8在Alb内含子上治愈A型血友病奠定了基础。

原文链接：

https://genomebiology.biomedcentral.com/track/pdf/10.1186/s13059-019-1907-9

来源：Plant_ihuman iNature

原文链接：http://mp.weixin.qq.com/s?__biz=MzU3MTE3MjUyOA==&mid=2247506259&idx=6&sn=dc38423541dfb43cea3162c8c5b49550&chksm=fce6aa8ccb91239ad0478177061097f75dd880b95b5f84bd3c86f92252bd5400a001e73e34f1&scene=27#wechat_redirect

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