论文导读：固本防哮饮在哮喘缓解期通过激活AMPK通路调节脂质代谢

文章信息

  1、UHPLC-ESI/LTQ-Orbitrap-MS              检测药材质量

典型的总离子色谱图（TIC）如图1所示。我们通过将保留时间和质量信息与对照物质的保留时间和质量信息匹配，总共鉴定出14种化学物质：五味子素A，甘草甜素，五味子醇A，黄芪甲苷I，甘草酸，黄芪甲苷 Ⅳ，黄芪皂苷Ⅲ，毛蕊异黄酮，异甘草甙，木兰苷，党参炔苷，甘草甙，升麻素苷（表1）。

  典型的总离子色谱图（TIC）如图1所示。我们通过将保留时间和质量信息与对照物质的保留时间和质量信息匹配，总共鉴定出14种化学物质：五味子素A，甘草甜素，五味子醇A，黄芪甲苷I，甘草酸，黄芪甲苷 Ⅳ，黄芪皂苷Ⅲ，毛蕊异黄酮，异甘草甙，木兰苷，党参炔苷，甘草甙，升麻素苷（表1）。

   2.GBFXD在哮喘缓解期和气道炎症小鼠模型中的作用

为评价GBFXD对小鼠哮喘及对炎症反应的影响，我们采用H&E染色法检测小鼠肺组织病理变化。模型组表现出轻度至中度的气道炎症，其特征在于气道和血管周围的炎性细胞浸润。与模型组相比，GBFXD-1（24 g / kg）和GBFXD-2（36 g / kg）的给药导致炎症评分显着下降（p <0.05）。阳性药孟鲁司特治疗也减少了炎症细胞的数量，但是差异不显着（p> 0.05，图2a，b）。

  肿瘤坏死因子α（TNF-α）主要由巨噬细胞产生，是炎症的关键调节因子，通过吸附炎性细胞，刺激炎性介质的产生，增加氧化应激和亚硝酸应激以及诱导气道来促进哮喘发作。在哮喘中，骨膜素被认为是2型炎症的生物标记，它调节皮下纤维化和粘液产生。因此，我们评估了每组肺组织中TNF-α和骨膜素的表达水平。

  如图2c，d所示，模型组的肺中TNF-α和骨膜素的水平高于对照组，而GBFXD组治疗后则有所恢复（p <0.05）。这些发现表明我们成功建立了哮喘缓解模型，GBFXD可以有效缓解哮喘缓解期的气道炎症。

  3.与GBFXD治疗相关的代谢变化

  PCA评分图中的QC样品簇显示集中，表明脂质体分析在正离子和负离子模式下的稳定性和可重复性。每组样品均采用UHPLC-Q-Orbitrap MS进行检测，所有代谢物使用MS-DIAL和LipidBlast数据库进行识别。我们在正离子模式下共鉴定出354种脂质，而在负离子模式下共鉴定出228种脂质。

  如图3a-d OPLS-DA分析显示，对照组，模型组和GBFXD组的聚类可以彼此分离。为了防止模型过度拟合，执行了1000次置换检验，以上结果表明该模型是稳定有效的。因此，该模型适用于鉴定候选差异代谢物。我们采用单因素方差分析(One-way ANOVA)来识别基于对数转换数据的显著差异表达的脂质。FDR和倍数变化阈值也用于筛选显著变化的脂质，然后通过对HMDB和PubChem的搜索来重新鉴定这些代谢物。共有42种脂质在两组比较中有显着差异：对照与模型以及模型与BFXD-2（表2和3）。

  图3e中总结了在阳离子模式下检测到的差异脂质。与对照组相比模型组中上调的标记物包括：4种酰基肉碱（ACar）和8种磷脂酰胆碱（PC）；而下调的标记物包括：19种甘油三酸酯（TG）、3种甘油二酯（DG）、2种PCs。这些结果表明，哮喘缓解的小鼠中ACar，PC，TG和DG的脂质代谢可能紊乱。用GBFXD处理后，所有ACar，2种DG和4种TG均被显着下调，而所有PC，15种TG和1种DG均被上调。

  我们在负离子模式下仅筛选出六个差异的脂质分子。如图3f所示，与对照组相比模型组中下调的标记物包括：两种PC和一种磷脂酰肌醇（PI）；而上调的标记物为磷脂酰乙醇胺（PE），脂肪酸（FA）和氧化脂肪酸（OxFA）。GBFXD治疗后，PC，PI和PE上调，FA和OxFA明显下调。

  4.使用靶向代谢组学对FA 16 : 1进行定量分析

  我们确定了一种脂肪酸和四种ACars在哮喘模型中升高，而在药物干预后降低（图4a）。先前的研究表明，哮喘患者存在脂肪酸代谢异常，而脂肪酸代谢在哮喘的发病机理以及气道炎症中起着至关重要的作用。因此，我们专注于脂肪酸代谢，并进行了以下实验。我们首先使用靶向代谢组学对脂肪酸16:1进行了定量分析。如图4b所示，脂肪酸16：1的靶标定量结果与以前的非目标研究一致。与对照组相比，哮喘模型组的这种代谢产物显着增加，而GBFXD显着回调了上升趋势（图4b）。

  5.GBFXD通过激活AMPK途径调节哮喘患者的脂肪酸代谢

我们收集了肺组织用于分析涉及AMPK途径的蛋白质，通过Western印迹测定，我们发现GBFXD-2组肺组织中AMPK蛋白的磷酸化水平显着高于哮喘组。GBFXD-2组的p-AMPK / AMPK比也显着增加（图5a，b）。

  哮喘组中SREBP-1和FASN的表达水平显着高于对照组，但在GBFXD组中显着降低（图5a，c，d）。

  这些结果表明GBFXD-2通过增加AMPK的磷酸化来调节下游的AMPK脂肪酸代谢信号传导途径。

实验讨论

  我们通过用RSV和OVA刺激建立了哮喘缓解的小鼠模型。GBFXD在造模后28天开始给药，孟鲁司特作为阳性药对照。通过评估肺部病理切片以及分析炎症细胞因子水平，我们证实了哮喘模型的成功建立（图2）。

  然后，我们通过LC-MS测定了小鼠的血清代谢谱，总共有42种脂质代谢产物被确定为GBFXD治疗的潜在靶标（图3e，f），其中，哮喘模型中一种脂肪酸和四种ACars升高，GBFXD治疗后显著回调（图4a）。酰基肉碱作为肉碱代谢的中间体，可以反映脂肪酸代谢失衡和线粒体应激。因此，我们集中研究于GBFXD对脂肪酸代谢的影响。

  II型肺泡上皮细胞（AEC2）产生肺表面活性剂，这是一种表面活性脂蛋白复合物，含有约90％的脂质，主要由磷脂，特别是磷脂酰胆碱，磷脂酰乙醇胺和磷脂酰肌醇组成。临床研究表明，哮喘患者痰液中的二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）含量降低，并且与肺功能变量FEV1（1 s的呼气量）有关。

  更重要的是，在大鼠中用外源性磷脂治疗会抑制支气管刺激性受体的神经活动。有直接和间接的证据表明表面活性剂在气道口径和过敏性炎症中的调节作用。这些与肺表面活性物质相关的脂质代谢产物在我们的实验中发生了显着变化（图3e，f）。与哮喘模型组相比，GBFXD干预后多数呈上升趋势，暗示GBFXD可能通过调节脂质代谢来维持脂质体内平衡，从而减轻哮喘的发生。

  然而，GBFXD是否通过增加AEC2细胞增加肺表面活性物质的分泌来缓解哮喘，从而改善肺功能，还需要进一步的详细分析。

  脂质是细胞结构形成的基础，可通过触发特定的生物学过程（作为第二信使）来影响各种细胞功能。脂质及其介体在包括哮喘在内的多种人类疾病中均具有促炎作用，其中脂肪酸与炎症之间的关系也得到了研究。脂肪酸作为信号传导化合物来调节代谢，转录和炎症反应。花生四烯酸是磷脂酶A2（PLA2）诱导的一种多不饱和脂肪酸，是前列腺素（PGs）和白三烯（LTs）的直接前体。

  LT通过刺激成纤维细胞趋化性，增殖和胶原合成的能力，在哮喘的发病机理中起关键介质的作用。PGD2和PGF2α可以诱导哮喘支气管收缩。两种物质都可以通过作用于树突状细胞，巨噬细胞和淋巴细胞而引发或增强炎症反应。

  人们认为亚油酸及其氧化产物可导致哮喘中的Th2分化，其12 / 15-脂氧合酶代谢产物13-S-羟基十八碳二烯酸（HODE）会引起线粒体功能障碍，严重的气道阻塞和嗜中性气道炎症。过量的饱和脂肪酸（SFA）可以在细胞凋亡后激活NLRP3，导致NLRP3炎性小体的组装，然后聚集并动员caspase-1，导致IL-1β的分泌。在我们的哮喘缓解实验模型中，脂肪酸（FA 16：1）显着升高，而GBFXD减弱了这种升高。

  我们推测，FA 16：1可能会通过增强炎症反应来影响哮喘，但其加剧气道炎症和引发哮喘的具体致病机制仍需进一步研究。

  脂肪酸合成涉及乙酸从头开始组装成饱和脂肪酸，以及饮食必需脂肪酸的去饱和和延长。AMPK是高度保守的代谢调节剂，可在代谢应激期间在细胞和生理水平上恢复能量平衡。最近的研究表明，AMPK对炎症性肺部疾病，例如哮喘，肺部感染性疾病和肺纤维化具有抗炎和保护作用。

  AMPK的抗炎功效可能与巨噬细胞向抗炎表型的极化增加有关，减少了活性氧（ROS）的产生，并抑制了NF-κB信号通路。此外，AMPK激活还可以防止TGF-β1诱导的气道平滑肌细胞增殖，并避免气道重塑，这也是哮喘的常见病理特征。

  AMPK的作用取决于激酶域激活环中保守的苏氨酸的磷酸化（按照惯例，称为Thr172），完全激活的AMPK抑制脂肪酸的合成。磷酸化的AMPK抑制脂肪生成的转录因子，最显着的是SREBP-1，这是一个关键的转录因子，参与调节编码脂肪酸合成酶的基因的表达，例如FASN和乙酰辅酶A羧化酶1（ACC1）。

  SREBP-1和FASN的表达水平在肺癌中显着升高，影响脂质代谢，从而影响肿瘤细胞迁移，细胞周期，细胞分裂和分化。FASN表达的增加也可以激活TGF-β信号转导并加重肺纤维化程度。AMPK / SREBP-1途径显示可影响游离脂肪酸诱导的肝脂肪变性和胆囊癌的细胞内脂质蓄积。

  在我们的实验中，哮喘模型中p-AMPK的表达降低，GBFXD治疗后p-AMPK的表达增加；哮喘模型组SREBP-1和FASN的表达上调，GBFXD治疗可抑制其上升趋势。这些结果表明GBFXD对脂肪酸代谢的影响可能是由AMPK途径介导的。

研究结论

  总之，我们获得了哮喘缓解期的代谢特征，并确定了由GBFXD调节的脂质代谢产物。该中药组方可通过改善相关的代谢紊乱来部分缓解哮喘小鼠的气道炎症，并且其对脂肪酸代谢的影响可能与AMPK途径的激活有关。我们的研究对哮喘缓解的代谢状态和发病机理以及GBFXD的潜在治疗作用机理提供了更深入的了解。

  但是，此处报道的实验并未证实脂肪酸（FA 16：1）如何加剧气道炎症并促进哮喘，应在以后的研究中对此进行研究。GBFXD调节脂质代谢紊乱，但是相关代谢产物如何影响哮喘加重值得进一步研究。

作者介绍

赵霞，南京中医药大学，教授，博士生导师，学院党委书记。

研究方向：从事中医儿科学临床、教学、科研工作10余年，主要进行小儿肺脾系疾病的临床与基础研究。

原文链接：

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33714782/

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编辑：王文岐

责任编辑：杨梓莹 郭晓萌

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