兰州大学潘建伟团队与合作者共同揭示网格蛋白依赖性外吞和内吞的耦合机制

2021年7月7日，The Plant Cell在线发表了兰州大学生命科学学院潘建伟教授团队与美国威斯康星大学麦迪逊分校生化系SebastianY.Bednarek教授等合作完成的题为“Cross-Talk between Clathrin-Dependent Post-Golgi Trafficking and Clathrin-Mediated Endocytosis in Arabidopsis Root Cells”的研究论文，山东农业大学张彦教授和北京林业大学林金星教授也参与了该项工作。该研究揭示了网格蛋白依赖性后高尔基体贩运与网格蛋白介导的内吞之间相互串扰以维持拟南芥根细胞内稳态，为植物细胞外吞和内吞作用的协调和耦合提供了新证据。

研究背景

后高尔基体分泌和胞内囊泡转运途径控制着细胞表面和膜蛋白的传递和回收，从而调控细胞生长和质膜（PM）上的多种生化过程，这对于细胞与环境之间的信息交流至关重要。位于PM和高尔基体反面网络/初级内体（TGN/EE）的网格蛋白在后高尔基体胞吐/胞吞途径中发挥关键作用。植物网格蛋白与PM或TGN/EE的结合及其介导的内吞（CME）依赖于进化上保守的异源四聚体复合物ADAPTOR PROTEIN2（AP-2）和植物特有的异源八聚体TPLATE复合物（TPC）两类接头蛋白。ADAPTOR PROTEIN1复合物（AP-1）在TGN/EE的网格蛋白依赖性分选和转运中起发挥功能。已有研究表明后高尔基体胞外贩运和内吞之间相互影响，然而，关于两者协调活动的内在机制还知之甚少。

研究结果

首先为检测AP-1功能是否对于网格蛋白定位以及招募至TGN/EE所必需，荧光观察结果显示AP-1复合物亚基与网格蛋白轻链CLC2共定位于拟南芥根细胞的TGN/EE，并且AP-1复合物亚基功能缺失导致TGN/EE相关的网格蛋白水平降低，表明网格蛋白的TGN/EE定位依赖于AP-1（图1）。进一步通过活细胞成像分析发现，AP1亚基缺失突变导致根细胞中TGN/EE驻留蛋白SYNTAXIN 41（SYP41）和SYP61错误定位到PM，且伴随蛋白含量的降低。

图1. 膜相关网格蛋白、AP-2和TPC在ap-1突变体根细胞中的水平降低

推测TGN/EE相关的网格蛋白或AP-1缺失可能影响胞外分泌，由此对网格蛋白及AP-1复合物亚基缺失突变体中的可溶性分泌标志物sec-GFP进行观察，结果发现突变体中的sec-GFP在胞内区室积累（图2）。另外，已知网格蛋白对于内在化PM蛋白再循环至PM至关重要，因此结合膜蛋白分析表明网格蛋白和AP-1对于分泌蛋白的外吞转运和内吞蛋白的PM再循环必不可少。除此之外，通过膜染料FM4-64指示检测表明AP-1也是内吞作用所必需的。进一步荧光观察及量化分析发现，在ap-1突变体中，PM和TGN/EE相关网格蛋白及其接头辅助蛋白水平显著降低，这可能是由于膜招募缺陷引起的，而并非表达水平变化或降解所致。

图2. 在ap-1、clc、chc突变体和ES2处理根系中Sec-GFP分泌受损

上述结果显示ap-1突变体中的内吞和外吞均受损，表明这些贩运途径存在互相关联。为进一步研究CME是否更广泛地依赖于外吞作用，利用外吞抑制剂处理后发现内吞以及CME蛋白招募至PM发生缺陷。这进一步表明由AP-1功能缺失或小分子抑制剂处理导致的外吞贩运抑制可导致CME受损。与此相对应的是，网格蛋白介导的内吞抑制同样导致胞外分泌受损。

前期研究表明内吞接头蛋白复合物AP-2或TPC缺陷导致PM和TGN/EE相关网格蛋白缺失，为检测AP-2和TPC功能是否也参与AP-1招募至TGN/EE，在不同遗传背景下进行活体成像观察发现，ap-2亚基突变体和TPC下调表达株系的根细胞中TGN/EE相关的AP1亚基水平显著降低（图3）。通过在ap2σ-1和amiR-TPLATE株系中观察CLC3-GFP和AP1σ2-GFP动态变化，表明AP-2/TPC功能缺失损害了TGN/EE招募网格蛋白和AP-1亚基的能力。

图3. 在ap-2和tpc突变体中TGN/EE相关的AP-1水平显著降低

一图解文

该研究表明后高尔基体贩运和CME通过调节网格蛋白和接头蛋白复合物募集到TGN/EE和PM来进行耦合，从而实现外吞和内吞的相互协调。近期研究表明，外吞和内吞稳态是花粉管顶端生长、低温耐受、气孔运动和渗透应激反应所必需的。因此，两者的耦合可能是发育和环境信号调控的关键环节。然而，参与协调网格蛋白及其接头蛋白招募至PM和TGN/EE的分子机制仍有待研究。

来源：植物科学最前沿