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近日，植物学报的特邀专家方法栏目在线发表题为“植物小RNA荧光原位杂交实验方法”的方法论文，该文详细介绍了基于超高分辨率显微镜的sRNA-FISH的具体操作流程以及注意事项, 该技术可用于探究植物组织内小RNA的表达与定位。
摘要：小RNA是对植物生长发育十分重要的一类小分子核苷酸, 在多种生命过程以及胁迫响应中发挥重要调控作用。对小RNA的定位研究有助于揭示它们的功能, 而小RNA荧光原位杂交(sRNA-FISH)是一种通过荧光检测技术对生物体内小 RNA进行定性或半定量分析的技术, 目前该技术已经在动物体内被广泛应用, 而在植物体内的应用还比较少。该文详细介绍了基于超高分辨率显微镜的sRNA-FISH的具体操作流程以及注意事项, 该技术可用于探究植物组织内小RNA的表达与定位。
注意事项：
(1) 荧光基团的选择可根据实验所用植物组织的自发荧光决定, 尽量选取与组织自发荧光激发波长相距较远的荧光基团偶联的二抗。
(2) 收集样品的自发荧光光谱时, 尽量选择与最后显微成像时相同时期和位置的植物材料进行自发荧光光谱收集, 以保证最后进行光谱拆分的准确性。
(3) 如果对照中含有非特异性信号, 可能是由于样品本身具有大量的自发荧光或者探针存在非特异性结合的情况。可尝试通过延长甘氨酸处理时间(5.6节步骤(3))以及更换探针的方式解决。
(4) 信号太弱可能是由于目标小RNA本身表达量低, 也可能是实验过程中探针与抗体浓度太低。建议尝试提高探针与抗体浓度以及延长抗体孵育时间, 或者尝试延长蛋白酶处理时间(5.6节步骤(2))。
(5) 组织外观变形可能是由于样品没有正确固定导致的, 可考虑在固定缓冲液中加入0.5%戊二醛。
(6) 背景过多。可能有多种因素导致背景过多(如洗涤不充分), 可考虑提高杂交温度, 或者增加探针杂交以及抗体孵育后的洗涤次数。
来源：植物科学最前沿
原文链接：http://mp.weixin.qq.com/s?__biz=MzIyOTY2NDYyNQ==&mid=2247518798&idx=2&sn=78f0d5764bf816cf736bd4aa7707ff23
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