蛋白组学研究再登Cell，揭示肺癌EGFR突变引起酪氨酸磷酸化信号重塑的分子机制

来源：精准医学与蛋白组学

酪氨酸磷酸化 (tyrosine phosphorylation) 可以通过控制蛋白的酶活、细胞定位以及蛋白之间的相互作用来调控多层级的信号网络，因此具有极其重要的生理和病理意义。已有研究表明，酪氨酸磷酸化水平的失调会导致多种疾病的发生，尤其是肿瘤[1]。比如说，在肺腺癌 (Lung adenocarcinoma) 中发现表皮生长因子受体 (EGFR) 的致癌突变 (oncogenic driver mutations) 非常常见[2]。遗憾的是，尽管这些酪氨酸激酶在肿瘤发生发展过程的重要性已经被熟知，但我们仍不清楚的是：致癌突变引起的酪氨酸磷酸化信号重塑是如何导致肿瘤的发生？

不久前，来自丹麦哥本哈根大学的Jesper V.Olsen教授科研团队在Cell杂志上发表了题为Oncogenic Mutations Rewire Signaling Pathways by Switching Protein Recruitment to Phosphotyrosine Sites的研究，他们开发了一套基于质谱技术检测互作蛋白组学的方法，在肺组织中成功鉴定出超过1000个由EGF介导的酪氨酸磷酸化位点，并揭示了EGFR致癌突变导致下游磷酸化信号重塑的具体分子机制。

首先，为了鉴定体内酪氨酸磷酸化信号如何逐级传导，作者给分别给实验组和对照组大鼠静脉注射EGF和生理盐水各处理5min，然后将大鼠的肺组织取出（样品策略）进行后续的全蛋白质组学测定、TiO2富集的苏氨酸/丝氨酸磷酸化蛋白组学鉴定以及酪氨酸磷酸化抗体富集的酪氨酸磷酸化蛋白组学鉴定（质谱策略）。作者共鉴定到超过45000条肽段，其中包括超过13000条苏氨酸/丝氨酸磷酸化肽段以及超过1000条酪氨酸磷酸化肽段。这与之前磷酸化蛋白组学鉴定的结果一致，即酪氨酸磷酸化蛋白占总磷酸化蛋白10%左右[3]。此外，作者一共鉴定到88个酪氨酸磷酸化位点在EGF刺激之后磷酸化水平显著上升，这说明这88个位点对于酪氨酸磷酸化信号传导至关重要。

由于酪氨酸磷酸化位点的激活往往作为支架蛋白的锚定位点从而为下游蛋白复合体形成提供必要条件。因此，为了探究在EGF刺激之后，酪氨酸磷酸化如何介导下游蛋白复合体的形成，作者用之前鉴定到的88个酪氨酸磷酸化位点为中心取前后各6个氨基酸合成88条带生物素标记的“诱饵”肽段，使得其能在组织裂解液中“俘获”对应的激酶蛋白，并进行后续的蛋白组学分析。最终，作者获取到了目前最全的EGF调控的酪氨酸磷酸化特异的蛋白互作数据库，作者鉴定到11个关键蛋白复合体，共74个蛋白参与EFG信号网络的传导，并描绘出了这74个蛋白之间的互作网络。此外，作者发现不同蛋白复合体对于酪氨酸磷酸化序列基序具有一定的选择性，比如说，GRB2/GRAP复合体倾向于结合pYxN基序，而PTPN6/PTPN11复合体则更倾向于结合pYVxL基序。这些结果表明酪氨酸磷酸化位点附近的氨基酸序列对于结合特定的蛋白复合体非常重要。

因此，作者推测EGFR酪氨酸磷酸化位点附近的突变很有可能会影响下游蛋白复合体的招募。EGFR P1091L被报道在肺癌里是一个高频突变，并且P1091位点恰好位于结合CRK复合体的酪氨酸磷酸化位点附近，此外，作者通过数据分析和生物信息学验证发现CRK复合体的确更倾向于结合pYxxP基序。基于这些线索，作者猜测肺癌患者的P1091L突变很有可能会阻碍CRK复合体与EGFR的结合,这一结论在WT和P1091L患者肺癌组织样品中得到了验证：作者发现P1091L突变使得CRK无法与EGFR互作，取而代之的是SH2B1/SHIP2复合体，这与之前的磷酸化基序分析结果一致。最后，作者在体外用A549细胞对P1091L突变的生物学功能进行了验证，结果表明P1091L突变体的ERK和AKT信号持续激活，并且具有更强的侵袭能力。

除了P1091L位点，作者还考察了其他五个肺癌中常见的EGFR突变--EGFR P1019S, EGFR N1094Y,EGFR N1112S, EGFR N1140S 以及 EGFR P1170S。这些结果都表明：酪氨酸磷酸化位点附近的突变的确可以作为分子开关调控下游复合体的招募。

综上，Jesper V.Olsen教授借助蛋白组学的分析手段描绘出当前最全面的组织特异性的EGFR酪氨酸磷酸化信号调控网络，更重要的是，在此基础上揭示了肺癌中EGFR突变致癌的分子机制，这对于今后的临床治疗具有很强的指导意义。

原文链接:

https://doi.org/10.1016/j.cell.2019.09.008