基于猪SLA-I三维结构和多肽组确定PRRS病毒T细胞表位

近日，国际免疫学期刊Frontiers in Immunology「2020 IF: 7.561」在线发表了中国农业大学动物医学院夏春教授课题组题论文：基于猪SLA-I三维结构和多肽组确定PRRS 病毒T细胞表位『Illumination of PRRSV Cytotoxic T Lymphocyte Epitopes by the Three-Dimensional Structure and Peptidome of Swine Lymphocyte Antigen ClassI，SLA-I』。

Frontiers in Immunology, 2020 IF: 7.561

为了推进细胞毒性T细胞表位（CTL表位）在预防兽医学中的应用，本文集成了蛋白晶体学和免疫学技术、以及通过在无特定病原体猪（SPF猪）上的一系列试验，阐明了SLA-1*1502限制性猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）CTL表位。

首先，通过体外实验组装了肽SLA-1*1502复合物（pSLA-1*1502），并对9条预测的PRRSV肽进行结合测定。

随后，阐明了SLA-1*1502复合物与一条高亲和力肽（NSP9-TMP9）的晶体结构。

晶体结构展示了pSLA-1*1502呈现的肽NSP9-TMP9的构象不同于已知的猪MHC-I 等位基因呈递肽的构象。

pSLA-1*1502结合肽中的两个连续的脯氨酸使NSP9-TMP9的P3和P4位之间的转折更加突出，并且，pSLA-1*1502的D口袋是结合肽的重要区域。

在此基础上，根据NSP9-TMP9肽的结构特征以及丙氨酸突变肽亲和力测定结果，确定了pSLA-1*1502结合肽的基序，随后，从四类PRRSV基因株中鉴定了4条能与SLA-1*1502匹配的潜在表位。

最后，构建了pSLA-1*1502-NSP9-TMP9四聚体，并用NSP9-TMP9肽免疫SPF猪（SLA-1*1502表型），采用了四聚体技术和ELISA测定IFN-γ表达量确定了该肽为PRRSV CTL表位。

此研究拟在从各种猪的重要病毒中鉴定出SLA-I限制性CTL表位，用于设计和研发有效的多肽疫苗。 

首先为了阐释PRRSV的CTL抗原表位，作者利用九条预测的来自PRRSV多肽来组装多肽-SLA-I∗1502复合物，最终得到并解析了NSP9-TMP9-SLA-I∗1502的复合体结构。图1，pSLA-I∗1502呈现的NSP9-TMP9多肽构象与已知pSLA-I∗0401和pSLA-3∗hs0202复合物呈现的多肽构象不同。两个连续的Pro残基使NSP9-TMP9的P3和P4之间的转角更加尖锐。pSLA-I∗1502的D口袋很独特，对结合多肽非常重要。

图1. （A）SLA-I*1502与多肽NSP9-TMP9的整体结构。（B）多肽NSP9-TMP9与抗原结合槽中的残基之间的相互作用。氢键用红色虚线表示。（C）多肽NSP9-TMP9的表面模式。P4-Pro和P8-Leu的大部分都位于抗原结合槽之外。

为了确定SLA-I∗1502的多肽结合基序，通过丙氨酸扫描对NSP9-TMP9肽进行了突变，并使用圆二色谱检测了这些突变肽与SLA-I∗1502复合物的稳定性。结果表明：P2-Ala，P3-Ala和P9-Ala突变体的结合稳定性显着低于野生型多肽NSP9-TMP9。同时根据pSLA-I∗1502抗原结合槽和结合多肽的特点，SLA-I∗1502结合多肽的基序预期包含以下组合：X-（S/M/F/W/T/V/I/L）-（L/P/M/F/S/N）-XXXXX-（F/Y/W）。根据此基序对源自四个典型PRRSV毒株全蛋白序列进行扫描和多肽表位预测：第一个分离的毒株VR2332；低毒力毒株HB-13.9；高致病性毒株JXwn06；中国最近一次流行的CHsx1401毒株（图2）。大多数受SLA-I∗1502限制的PRRSV多肽位于ORF1a和1b编码的非结构蛋白和RNA依赖性RNA聚合酶（RDRP）中。尽管在这四个PRRSV毒株中均存在许多SLA-I∗1502结合九肽（〜90条肽），但在四个毒株中仅发现了30个肽是完全保守的。

图2. 根据pSLA-I∗1502复合物结合多肽的基序，从不同PRRSV毒株中预测符合结合基序的多肽。

为了阐明预测到的PRRSV多肽的免疫原性，首先，构建了pSLA-I∗1502四聚体，使用九头SLA-1*1502基因型的SPF长白猪来检测多肽NSP9-TMP9的免疫原性（图3）。结果显示，在经MLV+NSP9-TMP9免疫的组中，pSLA-I∗1502四聚体和CD8双阳性细胞的比率约为〜0.5-1％，显著高于对照组（P=0.0305）。MLV免疫组明显高于对照组（P=0.0355）；然而，MLV + NSP9-TMP9免疫组与MLV免疫组之间无显着差异（P=0.0538）（图3B）。此外，检测每只猪外周血中猪IFN-γ的表达发现，在所有免疫猪中都可检测到分泌的IFN-γ，但低于所有对照猪中的最低可检测限（图3C）。这些数据表明，NSP9-TMP9作为CTL表位，可以刺激猪产生特异性CTL免疫反应。

图3. 多肽NSP9-TMP9的CTL表位的功能性鉴定。（A）SPF猪的免疫程序。将表达SLA-I∗1502的9只猪分成三组：MLV组，MLV +肽组和空白对照组。为MLV和MLV +肽组注射减毒的PRRSV疫苗作为首次免疫。7天后，向MLV +肽组注射与CFA混合的NSP9-TMP9多肽，并且向MLV组注射与CFA混合的MLV作为第二次免疫。在第14天，向MLV+肽组注射与IFA混合的NSP9-TMP9肽，并且向MLV组注射与IFA混合的MLV作为第三次免疫。对照组的猪分别注射PBS，去离子水和CFA，以及去离子水和IFA。（B）通过流式细胞术检测用PE标记的pSLA-I∗1502四聚体和FITC标记的抗CD8单克隆抗体染色的NSP9-TMP9特异性CTL。（C）通过ELISA检测对照组和免疫组分泌的IFN-γ含量。对照组的分泌IFN-γ含量低于最低可检测限（78 pg/mL）。

总之，该研究通过体外复性筛选了可与SLA-I∗1502结合成复合体的病毒多肽，解析了pSLA-I∗1502的晶体结构，分析了结合PRRSV多肽谱。并使用SLA-I∗1502的四聚体，通过流式细胞术和IFN-γ表达量的测定，鉴定了NSP9-TMP9的免疫原性。这项研究为鉴定SLA-I限制的病毒表位提供了一个系统技术，促进了猪表位疫苗的开发。使用此类策略研究的疫苗可以有效激活CTL免疫，并有可能逐步解决常规弱毒苗的安全性问题，为表位疫苗控制PRRS、甚至非洲猪瘟提供了新途径。

来源：Frontiers开放科学平台