中科院植物所王雷研究组揭示蛋白O-糖基化修饰精细调控生物钟周期的新机制

来源：植物科学最前沿

2019年12月31日，Molecular Plant杂志在线发表了中国科学院植物研究所植物分子生理学重点实验室王雷研究组完成的题为“Nuclear Localized O-fucosyltransferase SPY Facilitates PRR5 Proteolysis to Fine-tune the Pace of Arabidopsis Circadian Clock”的研究论文（Research Article），报道了岩藻糖基转移酶SPY通过对生物钟核心组分PRR5的O-岩藻糖基化修饰，进而影响PRR5蛋白的稳定性，从而在翻译后水平精确调控生物钟周期的新机制。

https://www.cell.com/molecular-plant/fulltext/S1674-2052(19)30410-1

生物钟是植物细胞中感知并预测光照和温度等环境因子昼夜周期性变化的精细时间机制，它通过协调代谢与能量状态以适应环境因子的昼夜动态变化，从而为植物的生长发育提供适应性优势[1]。生物钟周期紊乱会严重影响植物多种生理和发育关键过程，如开花时间和胁迫应答等。此外，王雷研究组2018年在Molecular Plant和2019年在Nucleic Acids Research杂志上发表的研究论文还分别揭示了植物生物钟调控叶片衰老进程和根的形态建成[2, 3]，充分说明维持相对稳定的植物生物钟周期的重要性。另一方面，植物的生物钟周期具有可调节性，生物钟周期长度可以被外界环境因子和代谢与能量状态、以及衰老进程等反馈调控[4, 5]。生物钟周期调控可以在生物钟核心组分从转录到翻译的多个层级上发生，如翻译后修饰如磷酸化和泛素化等。O-糖基化修饰是细胞内又一重要的翻译后修饰类别，在植物的生长与发育过程中发挥着重要的作用，但其是否参与植物生物钟精细调控及其相关机制还不清楚。

该研究通过植物活体发光实验结合生物钟表型的计算分析发现，与动物中作为O-β-N-乙酰葡糖胺修饰转移酶（O-GlcNAc）的SEC参与调控生物钟周期不同[6-8]，在植物中则主要是作为O-岩藻糖基化（O-Fucrose）修饰转移酶的SPY特异调控生物钟周期。

通过构建细胞核和质特异定位的SPY蛋白表达载体，结合植物活体发光的实验证据，发现SPY蛋白主要是在细胞核中参与调控生物钟周期。进一步通过免疫共沉淀结合质谱分析、酵母双杂交以及双分子荧光互补等筛选SPY蛋白的互作蛋白组，发现SPY蛋白的TPR结构域可以与生物钟核心组分PRR5蛋白的C-端在细胞核内互作，并将其O-岩藻糖基化，而SPY蛋白催化结构域的突变不影响与PRR5的互作，但是不能将其O-岩藻糖基化。细胞学观察和生化分析结果表明O-岩藻糖基化修饰虽不改变PRR5亚细胞定位，但会促进PRR5蛋白的降解。正反两方面的遗传学证据均表明PRR5在遗传上位于SPY的下游发挥作用。

SPY调控植物生物钟周期的机制

(A). 双光子激光扫描显微镜观察SPY细胞核与细胞质在转基因株系根尖的特异定位。(B). IP-MS鉴定到与SPY互作的生物钟蛋白PRR5。(C). SPY与PRR5特异的在细胞核互作。(D). 蛋白质印迹检测CHX处理后PRR5蛋白水平发现在SPY突变体中PRR5蛋白的降解速度变慢。(E). 植物活体发光实验显示spy-3突变体中生物钟早环基因CCA1的表达水平降低。(F). 持续红光条件下PRR5的突变能部分恢复SPY突变体的生物钟表型。(G). 简化的SPY调控生物钟周期的分子模型。

该研究成果表明尽管O-糖基化调节生物钟周期在演化上具有保守性，其在哺乳动物中主要是通过O-GlcNAc糖基化修饰，而在高等植物中则是通过O-岩藻糖基化修饰，为翻译后修饰精细调控植物生物钟周期提供了新见解。该研究也首次介绍了O-岩藻糖基化的生化鉴定方法，亦是首次发现O-岩藻糖基化可以调控蛋白稳定性，对理解O-岩藻糖基化对蛋白修饰的调控提供了新思路。

该论文由王雷研究组已毕业博士研究生王岩为第一作者，在读博士生何雨晴和苏晨也对本研究做出了重要贡献，美国杜克大学Rodolfo Zentella博士和孙太平教授为合作研究者，王雷研究员为通讯作者。该研究得到了中科院战略性先导科技专项和中科院前沿科学重点研究等项目的资助。

参考文献：

1、 Sanchez SE & Kay SA (2016) The Plant Circadian Clock: From a Simple Timekeeper to a Complex Developmental Manager. Cold Spring Harbor perspectives in biology 8 (12).

2、 Zhang Y, et al. (2018) Circadian Evening Complex Represses Jasmonate-Induced Leaf Senescence in Arabidopsis. Molecular Plant 11 (2):326-337.

3、 Li B, et al. (2019) PRR5, 7 and 9 positively modulate TOR signaling-mediated root cell proliferation by repressing TANDEM ZINC FINGER 1 in Arabidopsis. Nucleic Acids Research 47(10):5001-5015.

4、 Gil KE & Park CM (2019) Thermal adaptation and plasticity of the plant circadian clock. The New Phytologist 221(3):1215-1229.

5、 Webb AAR, Seki M, Satake A, & Caldana C (2019) Continuous dynamic adjustment of the plant circadian oscillator. Nature Communications 10(1):550.

6、 Kim EY, et al. (2012) A role for O-GlcNAcylation in setting circadian clock speed. Genes Dev 26(5):490-502.

7、 Li MD, et al. (2013) O-GlcNAc signaling entrains the circadian clock by inhibiting BMAL1/CLOCK ubiquitination. Cell Metab 17(2):303-310.

8、 Chu CS, et al. (2014) O-GlcNAcylation regulates EZH2 protein stability and function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 111(4):1355-1360.