首次实现植物单细胞水平RNA实时成像，揭示植物磷响应转录调控动态

撰文 | 常道

责编 | 王一

与动物和多数微生物相比，植物个体缺乏运动转移能力，必须直面复杂多变的自然环境，因此植物需要调节自身生理状态来适应环境。基因转录过程作为生命活动的重要环节，在植物改变自身生理状态过程中发挥重要的作用【1】。目前，研究转录的技术方法存在多种局限性，包括：1）通过表达荧光标记量化不同器官中mRNA的丰度时，由于需要长时间酶解来生产原生质体，限制了快速实时的动力学研究【2】；2）通过融合启动子和报告基因共同转录可以提供细胞水平分辨率的转录活动，但是积累到可检测水平的成熟荧光体所需时间较长，而且该过程往往不稳定，难以快速准确的检测转录活动【3】；3）前期的方法仅仅可以评估总RNA的水平，由于不同的RNA降解时间不统一，导致难以真实反映转录活动中RNA的变化【4】。单细胞水平RNA实时成像技术的发展为解决以上问题开了方便之门，根据报道，酵母、哺乳动物和果蝇胚胎中已经成功应用【5-7】，但是在植物中尚未有相关报道。

近日，来自法国的研究团队在Nature Plants杂志发表了题为Live single-cell transcriptional dynamics via RNA labelling during the phosphate response in plants的研究论文，首次在拟南芥中实现单细胞水平的RNA实时成像，并对磷营养在根中触发的转录机制进行了研究。

本研究中，研究人员首先对植物进行磷（Pi）饥饿和Pi再弥补实验，分析根和叶的RNA-seq数据变化，选择出两个基因（SPX1和UNI1）代表Pi匮乏状态时最高表达水平，且在缺磷/磷充足变化中表现出广泛动态变化。分析发现，同时鉴定到的22个转录本的快速下降是受几个关键蛋白转录控制的，包括PHR和SPX家族。值得注意的是，本研究中发现经典的荧光素酶转录融合并不会导致快速转录的抑制。随后研究人员运用创制了128xMS2标签转基因拟南芥株系，MS2是一个茎环结构的标签蛋白，可以特异性的绑定MCP蛋白二聚体【8】。经过磷处理表达量分析表明，SPX1启动子驱动下的MS2可以真实的反应SPX1基因表达的时空表达情况。

Identification of fast responsive transcripts regulated at the transcriptional level by phosphate resupply.

研究人员运用旋转盘共聚焦显微镜，从组织水平对植物进行成像，并细致评估了MCP-GFP融合蛋白在转录成像中的表现。首先用信号最强的pSPX1::MS2x128来描绘报告基因在根中的表达，随后测试了MCP-GFP是否可以真实的反应MS2标记的RNA，进行了smFISH和MCP-GFP成像。同时为了检测实验结果的可靠性，研究人员统计了两种颜色荧光的转录位点，发现MCP-GFP检测到的90-95%的位点都被MS2 smFISH标记；随后将观察结果拓展到其他拟南芥株系，结果显示，MS2-MCP系统在整个植物组织中均是一个强大而敏感的转录成像系统。根据smFISH可以检测单个RNA分子且能够定量分析RNA聚合酶II转录周期的优势，研究人员测量了转录位点的亮度，并使用可见的单分子来计算活性转录位点上新生RNA分子的绝对数量，结果显示拟南芥中基因转录是快速的，并且起始事件以“聚合酶护卫队”的形式一个接一个发生。

Quantitation of SPX1 transcription in fixed cells gives insights into transcription dynamics, ploidy and intrinsic versus extrinsic noise.

核内复制是一种特殊的细胞周期，这类细胞持续多轮DNA复制，但是不发生胞质分裂，从而使核内染色体多倍化，促进细胞和器官生长。根细胞中经常发生DNA的核内复制，远离根尖时，核内复制会从组织中间扩展到外部皮层或表皮细胞层【9】。研究中发现，在根的分化部分记录的图像显示了复杂的衰老组织的性质，存在许多转录位点，表明处于多倍体状态。随后，研究人员对每个细胞的活性等位基因数量进行定量分析，同时测量了具有不同活性转录位点的细胞中所有转录位点之间的距离，结果显示，在这些细胞中，一些转录位点已经合并成单一位点，似乎与人类细胞中的“转录工厂”类似。随后研究人员比较了单细胞不同等位基因的活性，重点研究了二倍体根冠细胞，发现大量细胞只有一个活性的转录位点或完全没有转录，首次发现植物细胞中可能由于基因破裂导致不连续转录的现象；相同细胞之间基因表达的差异受基因表达噪声的影响，噪声源分为两种：细胞内生化反应影响下的内部固有噪声和细胞周期或信号通路传导影响下的外部噪声【10】。研究人员对转录过程中内外噪声进行测量，发现内在噪声的影响较大，突出了拟南芥转录噪声内外差异及其定量的重要性。

最后，研究人员使用简化版的RootChip微流控系统结合可以快速改变磷酸盐溶液能力的活细胞成像技术，并采用了旋转圆盘显微镜，持续的观察到去Pi溶液导致SPX1启动子的破裂，而转录位点在几分钟内开始和停止。随后，研究人员分析了Pi在供给后转录活动的响应，发现Pi再补给的转录抑制也是迅速的，表明Pi触发的调控级联具有敏感性和快速性的特点，同时MS2和RT-qPCR结果进行比较，进一步彰显MS2系统在植物活细胞中获取转录调控图象的能力。

综上所述，本研究开发的植物单细胞RNA实时成像技术可以直接测定活细胞中RNA聚合酶II的活性，可以用于研究植物中影响转录活动的各种现象，其前所未有的时空分辨率为植物生理学的研究和应用提供了强大的工具。

参考文献：

【1】Lopez-Maury, L., Marguerat, S. & Bahler, J. Tuning gene expression to changing environments: from rapid responses to evolutionary adaptation. Nat. Rev. Genet. 9, 583–593 (2008).

【2】Birnbaum, K. et al. A gene expression map of the Arabidopsis root. Science 302, 1956–1960 (2003).

【3】Balleza, E., Kim, J. M. & Cluzel, P. Systematic characterization of maturation time of fuorescent proteins in living cells. Nat. Methods 15, 47–51 (2018).

【4】Sorenson, R. S., Deshotel, M. J., Johnson, K., Adler, F. R. & Sieburth, L. E. Arabidopsis mRNA decay landscape arises from specialized RNA decay substrates, decapping-mediated feedback, and redundancy. Proc. Natl Acad. Sci. USA 115, E1485–E1494 (2018).

【5】Bertrand, E. et al. Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast. Mol. Cell 2, 437–445 (1998).

【6】Fusco, D. et al. Single mRNA molecules demonstrate probabilistic movement in living mammalian cells. Curr. Biol. 13, 161–167 (2003).

【7】Lucas, T. et al. Live imaging of bicoid-dependent transcription in Drosophila embryos. Curr. Biol. 23, 2135–2139 (2013).

【8】Tantale, K. et al. A single-molecule view of transcription reveals convoys of RNA polymerases and multi-scale bursting. Nat. Commun. 7, 12248 (2016).

【9】Bhosale, R. et al. A spatiotemporal DNA endoploidy map of the Arabidopsis root reveals roles for the endocycle in root development and stress adaptation. Plant Cell 30, 2330–2351 (2018)

【10】Pichon, X., Lagha, M., Mueller, F. & Bertrand, E. A growing toolbox to image gene expression in single cells: sensitive approaches for demanding challenges. Mol. Cell 71, 468–480 (2018).

论文链接：

https://doi.org/10.1038/s41477-021-00981-3

来源：BioArt植物