跨越从研究到临床的鸿沟：单细胞技术在癌症免疫治疗中的应用

单细胞技术正逐步成为癌症研究的强大工具。通过单细胞技术检测，能够发现肿瘤内，特别是免疫治疗后每个细胞的分子状态，为理解肿瘤异质性、微环境细胞类型组成和细胞状态转变提供了可能。对于精准医学来说，分析临床样本非常重要，但在技术上极具挑战。近日，《Nature Cancer》发表了一篇名为“From bench to bedside: single-cell analysis for cancer immunotherapy”的文章，具体描述了包括空间转录组学和蛋白质学在内的单细胞技术从样本收集到数据分析的方法步骤，及其在癌症治疗研究中的应用。现有的，最常见的可用于肿瘤免疫治疗研究的单细胞技术包括用于转录分析的单细胞RNA测序（scRNA-seq）、用于蛋白质组学分析的质谱流式细胞术（CyTOF）和空间检测技术。这些技术提供了细胞的分子图谱，将细胞分为不同的细胞群，实现细胞类型注释，推测细胞状态转换以及关联的分子通路。以此，我们可以确定驱动每种不同细胞类型行为的途径，并推断与细胞状态变化相关的细胞内和细胞间相互作用。这些途径的推论被广泛用于当前肿瘤免疫学的临床研究。目前正在开发的精准医学策略是通过联合疗法重塑TME以提高免疫治疗敏感性。这个过程中，单细胞方法有望助力精准免疫治疗。

目前可用于了解肿瘤的细胞组成和细胞间相互作用的几种方法包括：

单细胞蛋白质组学 (CyTOF) 提供细胞组成和细胞状态信息。

单细胞转录组学可提供与（A）相同的分析，也可以提供细胞轨迹预测以及T细胞和B细胞免疫组库信息。空间技术能将细胞组成、状态、细胞相互作用相关联。

借助空间蛋白质组学及其单细胞分辨率，可以识别单个细胞类型并确定特定的细胞间相互作用。

空间转录组学虽然缺乏单细胞分辨率，但可以根据不同临近细胞之间受体和配体的分子表达预测细胞相互作用，并发现不同细胞壁龛之间的致癌途径。

图1：癌症分析的单细胞转录组学和蛋白质组学方法

在这个过程中，样本制备及数据分析是最重要的环节，基于肿瘤研究常见的流程和注意事项如下：

大多数非空间单细胞技术，如scRNA-seq和CyTOF，需要解离并获得活细胞进行分析（图1A和1B）。最常用的样品分离方法是酶消化。分离前的样品储存、酶的类型和孵育时间都会影响单细胞分析结果，因此必须针对每种肿瘤类型仔细优化。而空间检测技术是基于玻片开发的技术，该技术保留了组织结构，无需进行解离。空间蛋白质组可以对冷冻和福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样品进行检测（图1C）。当前的空间转录组测序方法依赖于冷冻样本，使用FFPE样本的方法正在开发中（图1D，目前10X Genomics公司刚刚推出针对FFPE样品的空间转录组技术）。对FFPE保存样品进行检测使得对处理后并长期储存的样品进行回顾性临床研究成为了可能。

数据分析

高通量单细胞或者空间组学数据分析的常规流程如下：

单细胞和空间数据分析将从原始数据预处理开始，以去除质量差的细胞和数据；批量校正以消除由于实验差异导致的样品间误差；数据填充以纠正实际数据缺失。

降维并使用聚类工具进行数据可视化和细胞类型注释，这些工具根据每个细胞群表达的特定marker进行注释。从这里开始，数据准备好进行下游分析，具体取决于应用的方法和生物学问题。

可以使用差异表达分析来识别分子改变。在转录组学数据中，还可以进行通路分析以确定癌症进展的驱动因素和对治疗的反应，以及预测细胞命运轨迹以了解肿瘤和 TME随时间的调节。

在蛋白质组学和转录组学数据中，可以对分子（例如，蛋白质标记物表达、细胞因子基因表达、受体-配体表达）和细胞相互作用（例如，细胞邻近分析）进行分析，从而鉴定可能驱动与癌症进展和对治疗的反应相关的不同特征。

最后，通过多组学方法对相同样本的蛋白质和基因表达分析 或T细胞和B细胞免疫组库分析与转录分析相结合，可增加细胞类型注释的准确性并研究它们在癌症演变和治疗反应中的作用。图2：单细胞和空间分析的数据分析流程和方法

单细胞和空间检测技术以及对应的数据分析流程作为癌症研究的工具正在迅速发展，分析方法的进步将在挖掘新发现方面发挥作用。但是，机制的验证实验仍然是将单细胞研究转化为可操作的治疗靶点的重要补充。

在转化免疫治疗研究中，对机制的最终检验是验证治疗干预对患者肿瘤内的TME的免疫调节。虽然可以应用单细胞技术来检测这些影响，但完整的机制研究需要时间进程分析，这将涉及从同一患者收集连续样本，但这是不可行的。虽然监测患者外周血的免疫细胞组库对于时间进程研究更可行，但比较肿瘤和外周血免疫细胞组成的单细胞研究已经发现了内在差异。因此，未来的研究需要提供肿瘤免疫和外周免疫图谱之间的更全面的比较，以便能够使用单细胞技术来鉴定治疗性生物标志物。

患者肿瘤之间的异质性以及无法在患者中测试多种治疗方案进一步挑战了转化研究中的单细胞机制研究。汇集临床试验研究和来自临床前模型的干扰研究的单细胞图谱可以为这类研究提供重要参考。用免疫疗法治疗的临床前模型的单细胞分析可以发现与治疗反应相关的细胞类型和通路，而对用相同疗法治疗的样本进行跨物种分析可以揭示哪些治疗反应是保守的。从单细胞数据集中比较小鼠和人类保守反应的新分析工具可以进一步支持临床前分析的模型选择，为临床试验的设计提供信息。图3：从小鼠到人体的高维分析研究将推动下一代精准癌症免疫疗法

技术的巨大成本给单细胞图谱研究带来了限制。因此，平衡好在队列样品中用蛋白质组学技术进行低维分析和利用选定的样本进行高维机制研究是实验设计关键的一步。在这些混合设计中，跨平台数据集成的计算算法可以提供重要的补充以平衡分子深度和样本量。实验、计算和统计之间的密切合作可以支持优化研究设计，也可以根据每个项目的转化研究目标优先考虑新的计算方法进行数据分析。多学科整合将帮助肿瘤研究领域克服这些挑战，并利用单细胞和空间平台在肿瘤免疫治疗方面取得新发现。

总体而言，技术的发展为癌症的理解和攻克提供了新的平台和手段。虽然发展是循序渐进，很多问题也是随着研究的深入一步步解决和出现新的问题，但我们也可以看到，现有的单细胞技术与空间技术已经让我们对癌症的真相和精准治疗的目标越来越接近，相信在接下来的时间里，科学家们会给我们带来更多惊喜。