更快速的核酸检测新技术

作者：StarrySky

开发准确高效的病毒检测方法，对于降低新型冠状病毒感染肺炎（COVID-19）的传播速度是极为必要的。在已有的检测技术基础上继续开发病毒检测技术，核心就是减少检测时间和增加检测通量。目前检测病毒RNA最为有效的方法是RT-qPCR，该方法也成为了目前检测病毒RNA的金标准，RT-qPCR首先将病毒RNA逆转录为cDNA，之后通过实时定量荧光PCR扩增cDNA检测荧光信号，作为一个两步法的检测方法，该方法检测一个样品需要超过60分钟的时间。

为了减少检测时间，在过去的一年中，大量的文献提出了用来检测新型冠状病毒（SARS-CoV-2）的新方法【1】。新冠病毒快速抗原（免疫测定）检测是一种快速的检测方法，该反应只需要30分钟，但是该方法的检测灵敏度低于核酸扩增检测方法，因此，研究的焦点在于减少核酸扩增检测的反应时间，等温DNA扩增方法可以加快扩增速度从而减少反应时间，最常用的等温扩增技术是环介导等温扩增技术（LAMP）。RT-LAMP检测方法现在已经应用于SARS-CoV-2的检测，该方法目前测定一次结果平均需要20分钟，如何在环介导等温扩增技术（LAMP）基础上进一步减少检测时间成为了一项极具挑战性的研究。

近日，来自英国博敏翰大学生命科学学院的Timothy R. Dafforn和化学学院的James H. R. Tucker共同在PNAS期刊上发表了题为 Ultrarapid detection of SARS-CoV-2 RNA using a reverse transcription–free exponential amplification reaction, RTF-EXPAR 的文章。该研究展示了一种指数扩增反应（EXPAR）替代等温扩增技术的新方法，该方法是一种比LAMP更简单更快速的扩增方法。研究人员进一步将EXPAR与一种前所未有的无逆转录（RTF）步骤从RNA中产生DNA的技术结合在一起，发明了一种全新的核酸扩增技术（RTF-EXPAR），该技术可以在10分钟内准确检测到低浓度SARS-Cov-2病毒RNA（7.25 copies/uL）。

EXPAR能快速检测病毒RNA的关键有两部分。第一，扩增反应是一个等温过程，这样就避免了耗时的加热和冷却步骤；第二，扩增的链相比PCR和LAMP更小。这两个关键因素使得EXPAR反应一旦被触发，就能在几分钟内产生大量的DNA产物有效地放大检测信号。确定最优的核酸检测靶向序列是EXPAR检测方发展的重要部分，研究人员设计的核酸检测序列来自于SARS-CoV-2病毒基因组的保守基因Orf1ab，研究人员首先对该序列的扩增速度、灵敏性和特异性进行了检测，低浓度（10pM）序列检测到信号的扩增时间是8.67±1.08分钟，而高浓度（10nM）序列检测到信号的扩增时间是3.17±0.14分钟，无靶向性对照序列10分钟扩增后无检测信号。另一方面，有研究发现核酸内切酶BstNI可以选择性地剪切DNA:RNA杂交双链中的DNA片段，研究人员利用BstNI的位点剪切特异性开发了无逆转录步骤从RNA生成短链DNA的快速方法（图1）。

图1：RTF-EXPAR反应示意图

RTF-EXPAR是一个分两步进行的方法，需要首先从RNA中利用酶解产生DNA片段，之后再扩增DNA片段放大病毒RNA的检测信号。研究人员为了进一步提高反应时间，将两步反应合二为一，在同一个反应体系里完成了两步反应，在“一步法”的条件下，相同阳性样品的检测时间从“两步法”的平均10.33分钟减少到了平均4分钟。

接下来，研究团队对RTF-EXPAR“一步法”，RT-qPCR和RT-LAMP进行了比较。“金标准”技术RT-qPCR检测信号的最低浓度（0.725 copies/uL）时间为46.27±0.47分钟，最高浓度（1450 copies/uL）时间为34.00±0.00分钟；RT-LAMP检测信号的最低浓度（7.25 copies/uL）时间为13.83±0.82分钟，最高浓度（1450 copies/uL）时间为11.25±0.20分钟；RTF-EXPAR检测信号的最低浓度（7.25 copies/uL）时间为8.75±0.35分钟，最高浓度（1450 copies/uL）时间为3.08±0.42分钟（图2）。为了进一步比较三种方法的灵敏性，研究人员用三种方法对热失活的SARS-CoV-2病毒RNA进行了检测，以RT-LAMP方法的检测极限浓度（420 viral copies/uL）为标准，RTF-EXPAR的检测时间（7.67 ± 0.24 min）比RT-qPCR的检测时间（49.33 ± 1.25 min）快6倍，比RT-LAMP的检测时间（15.75 ± 0.20 min）快2倍。最后，研究人员也比较了RTF-EXPAR对不同常见呼吸道病原体的检测特异性，结果显示该方法能更快速地检测到阳性样品和SARS-CoV-2病毒RNA，这说明该方法具有很高的检测特异性。

图2：SARS-CoV-2 RNA三种方法检测结果（A. RTF-EXPAR, B. RT-LAMP, C. RT-qPCR）

综上，研究人员开发出了一种等温、无需逆转录步骤的RNA检测方法，这一方法检测样品的时间、灵敏度均优于目前最为常用的RT-qPCR和RT-LAMP方法，检测速度的提高也有助于提高样品检测的通量。综合RTF-EXPAR“一步法”的快速性和简便性，研究人员认为该方法有望部署在娱乐场所、机场到达终端和没有临床检测实验室的偏远地区。不仅如此，研究人员认为RTF-EXPAR方法不仅适用于当前的SARS-CoV-2病毒RNA的检测，也将适用与植物、动物和人类疾病相关病毒病原体的检测。

原文链接：

https://doi.org/10.1073/pnas.2100347118

1. M. N. Esbin et al., Overcoming the botteneck to widespread testing: A rapid review of nucleic acid testing approaches for COVID-19 detection. RNA 26, 771–783 (2020).