自然：蛋白表达调控新系统：Xon系统

作者：十一月

目前为止，基因疗法尚且依赖一些无法进行精细调控的复杂载体【1,2】。2021年7月28日，为了达到对基因疗法的精确控制，费城儿童医院Beverly L. Davidson研究组与Alex Mas Monteys（第一作者）发文题为Regulated control of gene therapies by drug-induced splicing，建立了一个药物诱导可变剪接从而调控基因治疗中蛋白表达的新系统X^on系统，该系统适用于任何需要表达精细控制的生物学问题或者药物的临床施用。

基于病毒和非病毒基因治疗方法在过去的几十年中已经取得了卓越的进展，但是目前关于货物递送系统中还存在一定的局限。例如通过病毒衣壳蛋白的进化和工程对腺病毒进行了改进和优化，使得该技术靶向应用的前景得到了进一步地扩展。除此之外，脂质纳米颗粒的优化使其吸收能力得到提高。但是目前货物本身以及控制货运表达的元件却尚未被关注【3】。

为了解决这个问题，作者们开发了一种通过药物诱导开关精细控制蛋白质翻译的方法称为X^on系统。该系统主要依赖于RNA的选择性剪接，该机制指的是通过包含或排除不同编码蛋白质的外显子、部分外显子以及不同的5’和3'非编码外显子来提供RNA和蛋白质多样性的机制【4】。X^on系统的基本原理是通过控制选择性剪接，可以调节某些外显子被保留或者是切除，而这种选择性剪接的进行只依赖于外源药物的加入而不依赖与其他的调控元件。因此，该系统可以应用于任何感兴趣的细胞或者是动物系统之中。

选择性剪接的调控蛋白质翻译这一目标可以通过脊髓性肌肉萎缩（Spinal muscular atroph）治疗药物的处理达到。脊髓性肌肉萎缩主要是由SMN1水平的降低造成的。SMN2是SMN1的假基因，但是其正确剪接的几率只有10%左右，可以产生与SMN1功能相当的SMN2蛋白。其中有两种药物LMI070与RG7800/RG7619可以用于提高SMN2正确剪接的概率。作者们发现LMI070的诱导活性高于RG7800（图1），因此随后作者们将目光集中到了LMI070药物上。

图1 X^on系统的工作原理以及LMI070的高诱导活性

但是由于完全剪接开关需要的药物剂量不太可能转化到临床，作者们希望进一步寻找剪接对治疗相关条件有更灵敏响应的外显子作为X^on系统的组件。为此，作者们用25 nM LMI070处理HEK293细胞12 h，并进行RNA测序，以确定只在药物处理条件下存在的选择性剪接外显子。在其中，作者们发现了45个药物诱导的RNA选择性剪接事件，其中LMI070诱导的SF3B3外显子选择性剪接时间在自然条件下完全不会发生。因此，该外显子可以作为X^on系统的备选组件。

在确认了应用于X^on系统的组件之后，作者们希望对X^on对不同启动子的诱导进行比较，发现常见的启动子均会驱动剂量响应的诱导表达，但是强度不同。因此不同的启动子可以为梯度诱导提供可能的工具。

为了对X^on系统在体内的功用进行评估，作者们将eGFP克隆到了载体之中，并包装进入AAV9之中。AAV9-X^on-eGFP可以被静脉注射进入小鼠之中，随后通过给药对eGFP的表达进行检测。作者们发现，在24h后小鼠的肝脏和心脏切片中出现了显著的eGFP信号。因此，LMI070药物能够稳健地诱导基因表达。随后，作者们又对X^on系统控制红细胞生成素的效果进行评估，红细胞生成素主要用于治疗慢性肾病【5】。通过将X^on系统中加入红细生成素，并包装在AAV8中静脉注射给小鼠，随后用LMI070或载体对小鼠进行药物处理。作者们发现与对照载体相比，LMI070药物处理可以显著提高红细胞生成素的表达。另外，通过大脑靶向的基因包装进入X^on系统之中，作者们发现该系统也可以以一种剂量依赖的方式诱导蛋白的表达。

有些基因治疗的方式只能在一个非常窄的治疗表达窗口中发挥作用，作者们发现X^on系统也可以很好地应用在这些精确表达框的案例之中。另外，作者们希望进一步扩大X^on系统的应用，为此我，作者们希望在该系统中引入SaCas9的基因编辑功能。考虑到AAV装载限度，作者们对X^on系统进行优化，发展出了一种更小版本的miniX^on系统，进一步扩展了X^on系统在基因编辑应用中控制Cas9蛋白翻译的应用。

总的来说，作者们开发出了一种简单、适应性强的蛋白表达调控工具系统X^on，该系统可以对蛋白表达量进行稳健的控制，诱导的程度主要由启动子强度以及可变剪接药物的剂量进行控制，该系统可以适用于任何需要精细表达控制生物学场景。

原文链接：

https://doi.org/10.1038/s41586-021-03770-2

1 Yen, L. et al. Exogenous control of mammalian gene expression through modulation of RNA self-cleavage. Nature 431, 471-476, doi:10.1038/nature02844 (2004).

2 Dow, L. E. et al. Inducible in vivo genome editing with CRISPR-Cas9. Nature biotechnology 33, 390-394, doi:10.1038/nbt.3155 (2015).

3 Domenger, C. & Grimm, D. Next-generation AAV vectors-do not judge a virus (only) by its cover. Human molecular genetics 28, R3-r14, doi:10.1093/hmg/ddz148 (2019).

4 Berget, S. M., Moore, C. & Sharp, P. A. Spliced segments at the 5' terminus of adenovirus 2 late mRNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 74, 3171-3175, doi:10.1073/pnas.74.8.3171 (1977).

5 Eschbach, J. W., Kelly, M. R., Haley, N. R., Abels, R. I. & Adamson, J. W. Treatment of the anemia of progressive renal failure with recombinant human erythropoietin. The New England journal of medicine 321, 158-163, doi:10.1056/nejm198907203210305 (1989).