南京大学鞠熀先教授课题组JACS：DNA跨膜逻辑运算用于肿瘤的精准光动力治疗

DNA纳米机器是基于DNA自组装形成的纳米结构。通过嵌入功能核酸单元，DNA纳米机器可以响应肿瘤细胞内源性刺激物而引发结构变化，实现肿瘤细胞成像或治疗。

近日，南京大学鞠熀先教授课题组设计了一种跨细胞膜进行DNA逻辑门运算的纳米机器，在细胞膜表面与细胞质内分别完成其两步DNA运算，避免了DNA纳米机器在实体瘤微环境中的非特异性激活，实现了活体内实体肿瘤的精准光动力治疗。相关成果在线发表于J. Am. Chem. Soc.（DOI:10.1021/jacs.1c06361）。

前沿科研成果

DNA跨膜逻辑运算用于肿瘤的精准光动力治疗

实体肿瘤的微环境复杂，肿瘤细胞周边存在大量有重要功能的健康细胞（如成纤维细胞、免疫细胞等）。传统的DNA纳米机器往往会因实体瘤微环境中内源性刺激物的影响，在其进入靶向肿瘤细胞前被误启动，对周围健康细胞造成毒副作用损伤。因此，开发一种在细胞水平上特异性激活的纳米机器，对于肿瘤的精准治疗具有重要意义。

通过核酸适配体与细胞膜上膜蛋白的结合，可使DNA纳米机器在细胞膜表面进行逻辑运算而产生输出信号。在前期研究中，生命分析化学国家重点实验室（南京大学）鞠熀先教授报道了基于核酸适配体和细胞膜上双受体结合的“双锁-智能钥匙”DNA逻辑门模型，并在肿瘤细胞识别与肿瘤治疗中实现了细胞亚型特异性的区分（Nat. Commun. 2016, 7, 13580）。然而，在细胞膜表面完成“逻辑门”运算需要依赖DNA链在细胞膜上的迁移。这一过程依靠DNA链的“脱落与再结合”，效率受限，且易产生假阳性结果。为解决这一问题，鞠熀先与刘颖教授设计了一种跨细胞膜进行DNA逻辑门运算的纳米机器（图1a），其两步DNA运算分别在细胞膜上与细胞质内完成，可避免DNA纳米探针在实体瘤微环境中的非特异性激活，实现了活体内实体肿瘤的精准光动力治疗。该DNA纳米机器由上转换纳米粒子内核（UCNPs）、DNA组装体L012和H012组成（图1b）。含sgc8适配体的DNA链LA-apt与癌细胞膜上过表达的PTK-7蛋白结合，构成信号输入端1；癌细胞内高表达的miRNA-21作为信号输入端2。这两个信号输入端与DNA纳米机器上的L012部分共同形成“AND”逻辑门。

DNA纳米机器进行跨膜逻辑运算的过程如下：LA-apt与L012在细胞膜表面杂交，取代L1链后暴露miRNA-21的结合位点，并诱导纳米粒子进入细胞质；细胞质中的miRNA-21与纳米粒子上的L012发生链取代反应，输出信号（即释放的L2链）（图1c）；释放出的L2链打开UCNPs表面修饰的H1发卡，并随后打开H2发卡重新释放L2链进行下一循环。这一过程可不断恢复光敏剂的活性，在UCNPs的绿色发射光的激发下产生活性氧，实现肿瘤细胞的光动力治疗（图1d）。

图1.（a）DNA跨膜逻辑门运算与（b）DNA纳米机器结构示意图；（c）以LA-apt与PTK-7蛋白结合构成信号输入端1、miRNA-21为信号输入端2进行跨膜运算而释放L2；（d）L2启动循环反应恢复光敏剂活性。

将ROS指示剂DHR123修饰在DNA纳米机器上可验证细胞内精准光动力治疗。在细胞表面锚定LA-apt后，UCNPs-DNARB/BHQ孵育的MCF-7细胞在近红外光照下有明显的ROS产生（图2a），而其对照物则不能被产生ROS（图2b）。miRNA识别位点未被封闭的对照材料UCNPs-DNA'RB/BHQ与miRNA-21孵育后，在miRNA-21阴性的MCF-7细胞中显示明显的ROS荧光；而UCNPs-DNARB/BHQ此细胞中并没有ROS产生（图2c）。因此，封闭miRNA识别位点可保证光动力治疗仅在肿瘤细胞内发生，避免对正常细胞组织的损伤，从而实现癌细胞的精准高效光动力治疗（图2e）。

图2.（a）LA-apt和（b）LA'-apt锚定的UCNPs-DNARB/BHQ处理MCF-7细胞后的共聚焦成像；（c）LA-apt锚定miRNA-21阴性的MCF-7细胞在UCNPs-DNARB/BHQ或UCNPs-DNA'RB/BHQ处理后的共聚焦成像；（d）MCF-7对照细胞与分别不同方式处理后的MCF-7细胞的细胞存活率；（e）MCF-7对照细胞、在UCNPs-DNARB/BHQ（LA-apt+A）、UCNPs-nrDNARB/BHQ（LA-apt+B）或UCNPs-DNA（LA-apt+C）处理后的LA-apt锚定MCF-7细胞、UCNPs-DNARB/BHQ处理后（LA'-apt+A）的LA'-apt锚定细胞的细胞增殖率。

DNA纳米机器进行光动力治疗的效果在动物水平上也得到验证（图3）。通过在UCNP表面与L0链末端分别标记Cy3以及Cy5，得到双色纳米机器UCNPsCy3-DNABHQ-Cy5，同时发卡H1末端修饰的BHQ使Cy3荧光的猝灭。通过Cy5对DNA纳米机器在活体内的递运示踪，通过Cy3的荧光恢复显示DNA纳米机器的激活。从小鼠荧光成像可看出，尽管纳米材料会部分进入肝脏，只有肿瘤处有明显的Cy3荧光，证明该DNA纳米机器的跨膜运算仅在肿瘤细胞中激活，而不会对正常器官组织造成损伤。

图3. 注射LA-apt或LA'-apt、随后UCNPsCy3-DNABHQ-Cy5或UCNPsCy3-DNA'BHQ-Cy5小鼠的（a）活体荧光成像与（b）器官和肿瘤组织成像。

研究工作由博士生张玥和陈伟伟副研究员共同完成，鞠熀先教授和刘颖教授为共同通讯作者。

近三年来，该课题组在“癌症高效精准诊疗中的上转换纳米探针的研制及其性能研究”方面取得一系性创新成果：设计了发光增强的“能量集中域”结构上转换纳米材料（Angew. Chem. Int. Ed. 2019, 58, 12117-12122），开发了中继式能量传递模式提高了能量转移效率（CCS Chem. 2021, 3, 1510-1521），实现了上转换发光驱动的DNA偶氮苯纳米泵用于化疗药物的可控释放（Angew. Chem. Int. Ed. 2019, 58, 18207-18211）和近红外光响应microRNA放大器的早期癌症精准光动力治疗（Angew. Chem. Int. Ed. 2020, 59, 21454-21459），提出近红外光控上转换纳米颗粒的siRNA递运及基因与光动力治疗策略（Biomaterials 2018, 163, 55-66、2019, 225, 119501与2021, 275, 120962; ACS Applied Mater. Interf. 2020, 12, 19313-19323、2021, 13, 14951–14963与2021, 13, 31452–31461; Chem. Sci. 11, 2020, 6289-6296），通过近红外光瞬间点燃上转换纳米炸弹，实现了快速药物释放和癌症高效治疗（J. Control. Release 2021, 336, 469-479）。