Nature子刊：AAV介导的体细胞基因编辑，改善杜氏肌营养不良症

来源：BioWorld

杜氏肌营养不良（Duchenne muscular dystrophy, DMD）是X染色体隐性遗传疾病，常见于男孩，会引发儿童的肌肉退化并由于呼吸和心脏衰竭而引发早亡。大多数的病人带有DMD基因编码的肌营养不良蛋白（Dystrophin）的移码突变，该移码突变会造成外显子删除进而造成该蛋白表达缺失。由于DMD在X染色体上的定位使得每3500-5000个新生男孩中就有一例杜氏肌营养不良患者。目前反义寡核苷酸介导的外显子跳跃式重组DMD转录已被转化为临床试验，但由于反义寡核苷酸的对于DMD表达仅具有暂时的、有限的作用，在临床方面应对杜氏肌营养不良还没有更加行之有效的手段。

为了找到杜氏肌营养不良的治疗方案，2020年1月27日，慕尼黑工业大学和德国心血管研究中心C. Kupatt研究组在 Nature Medicine 题为：Somatic gene editing ameliorates skeletal and cardiac muscle failure in pig and human models of Duchenne muscular dystrophy 的论文，使用腺相关病毒（AAV）的静脉注射方式在体内利用基因编辑技术恢复的病人体内肌营养不良蛋白的表达，为杜氏肌营养不良的患者提供了可能的治疗手段。

在小鼠模型中，基于内切酶的基因编辑策略提供了更有效和更持久的基因组校正。最近，在犬类模型中使用基于腺相关病毒AAV9静脉注射的技术将CRISPR-Cas9组分的送入体内能够恢复包括心肌在内的肌肉中肌营养不良蛋白的表达。

但是到目前为止，该技术在体内的功能性方面的实验数据还未见报道。作者们在之前的工作中建立了一个DMD基因 exon52缺失的猪模型，该外显子的缺失会造成肌营养不良蛋白表达的完全缺失。作者们在此猪模型中注射CRISPR-Cas9靶向exon51的gRNAs组分，在猪模型体内恢复了一个短截但表达稳定版本的肌营养不良蛋白ΔE51-52 (图1)。

图1 在猪模型中进行的DMD基因编辑恢复短截版肌营养不良蛋白的表达

通过质谱分析后，作者们发现此种短截版本的肌营养不良蛋白的产生一定程度上纠正了DMD移码突变引发的蛋白质调控异常。在DMDΔ52模型中，由于缺少肌营养不良蛋白会造成肌营养不良蛋白相关糖蛋白复合体 (Dystrophin-associated glycoprotein complex, DGC) 表达的缺失。而在对猪模型进行腺病毒处理之后，作者们发现DGC的表达被恢复。DMDΔ52模型显示，在雄性后代出生后61.6%一周内死亡，全部雄性幼体无一存活超过105天。而在基因编辑处理之后，存活天数最大达到136天。为了进一步确认基因编辑之后对于杜氏肌营养不良的功能方面的作用，作者们检测了对于DMD心脏整体功能和心律失常等病理性特征的影响。在对DMDΔ52猪模型施用了基因编辑的腺病毒静脉注射之后，通过去除外显子51改善了该疾病模型中固有的心律失常的病理性特征。

进一步地，作者们希望在人类细胞中进行相应的检测。作者们从病人体内产生了一个带有DMD exon52删除 (hDMDΔ52) 的诱导多能干细胞株系，会引起外显子53提前终止。hDMDΔ52细胞表达的骨骼肌基因水平显着降低，并且无法生成多核且自发收缩的肌管。而在同样进行基因编辑处理切除外显子51重新表达短截版本的肌营养不良蛋白后，诱导多能干细胞产生的心肌细胞的心律失常等缺陷被修复了。

图2 人体诱导多能干细胞hDMDΔ52进行基因编辑后恢复肌管细胞的产生

总的来说，作者们的工作在大动物疾病模型中使用体细胞基因组编辑的方式能够改善杜氏肌营养不良疾病引发的肌肉无力、心肌疾病和过早死亡，从体内和体外均证明了该基因编辑恢复了DMD阅读框。

基因编辑后形成短截版本的肌营养不良蛋白也足以恢复肌肉的功能和移动性从而阻止恶性心律失常来延长杜氏肌营养不良DMDΔ52猪模型的寿命。在临床方面，腺相关病毒基因编辑技术在杜氏肌营养不良患者身上的应用仍待进一步地证明。

论文链接：

https://doi.org/10.1038/s41591-019-0738-2