李冰凌JACS: 低噪音纳米孔在单分子层面实现对DNA分子机器反应的原位追踪

来源：纳米人

第一作者：祝振童、段晓征

通讯作者：李冰凌

通讯单位：中科院长春应化所电分析化学国家重点实验室

研究亮点：

1. 测试发现最高介电常数的两种分子甲酰胺和甲基甲酰胺能够显示出最佳的降噪效果。

2. 通过分子动力学模拟提供了另外一种可能的降噪机制：即高介电常数分子的引入可引起溶液中离子簇的解体，增强离子溶剂化作用，使离子分布更加均匀，从而降低离子密度和迁移率涨落，减少电噪音的产生。

3. 利用GCN成功识别了一系列由核酸分子线路反应生产的DNA组装寡聚物作为降噪方法的实用性验证。

固相纳米孔分析技术面临挑战

固相纳米孔分析技术是近年来最具发展前途的单分子测量技术之一。因其具备单分子级分辨率以及免标记、免分离等技术优势，在分子检测、结构识别、信息存储检索等研究领域展示出巨大的研究潜力。然而，在实际操作中，伴随信号产生的基线电流噪音（电噪音）往往会直接限制固相纳米孔在时间和空间上的分辨率，以及数据采集的可靠性和稳定性，因此被视为影响固相纳米孔实用性的一个重要制约因素。这一弊端在小尺寸靶标的检测过程中尤为致命。 

成果简介

为此，中国科学院长春应用化学研究所李冰凌、祝振童和段晓征等人通过将具有高介电常数的有机溶剂分子添加到传统水相电解质中，发展出一种非常简单、高效的降噪方法，大幅度提升了固相纳米孔对小尺寸靶标的识别分辨率；并通过实验和分子动力学模拟的紧密结合，对溶剂介电性质（和溶剂分子偶极效应）在降噪过程中的重要作用进行了解析。 

要点1：甲酰胺的显著降噪现象

文章主要选择孔径在5nm左右的石英玻璃纳米孔（GCN，或glassnano-pipette）做为研究对象。在所有经过测试的溶剂分子中，具有最高介电常数的两种分子——甲酰胺和甲基甲酰胺——显示出最佳的降噪效果。20%体积分数的甲酰胺即可在低频极限处将功率能谱密度（PSD）降低3个数量级，从而大幅提高GCN裸孔的空间分辨率，使其能够精确地捕获到尺寸小于100个碱基的ssDNA及其杂交行为。在通用性实验中，该降噪方法被证明对氮化硅纳米孔同样有效。

图1. a)纳米孔检测示意图。b)石英玻璃纳米孔电镜照片。c)电流信号示意图。有无甲酰胺存在条件下的d)原始电流信号记录，e）事件统计图和f)功率谱密度。 

要点2：降噪机理研究

文章同时对可能的降噪机理进行了讨论。介于电噪音来源的复杂性和多样性，降噪机理的完整解析难度较大。除了玻璃管壁动态修饰、减少气泡和降低热噪音等常被报道的原因，作者还通过分子动力学模拟提供了另外一种可能的降噪机制：即高介电常数分子的引入可引起溶液中离子簇的解体，增强离子溶剂化作用，使离子分布更加均匀，从而降低离子密度和迁移率涨落，减少电噪音的产生。

图2.a-b)离子电流噪音降低原理示意。c-d)分子动力学模拟快照。e)每个阳离子相邻阴离子和溶剂分子的数量。f)阳离子的密度标准偏差与密度比，及迁移率标准偏差 与迁移率比。g) MD模拟获得的I-t曲线。h-i)5000bp dsDNA在甲基甲酰胺存在时的穿孔信号及相应的功率谱密度。 

要点3：低噪音纳米孔对核酸分子线路反应的原位跟踪

作为文章降噪方法的实用性验证，作者利用GCN成功识别了一系列由核酸分子线路反应生产的DNA组装寡聚物，包括双链产物 (duplex structure)，三链复合结构 （3-way structure），双聚-三链复合结构 (3-way-structure dimer)，以及四链复合结构 (4-way structure)。结果表明降噪之后，GCN在分辨率上有望对尺度和聚合度不同的DNA寡聚物进行有效识别和区分。这一现象有助于推进固相纳米孔在精细结构表征和信息存储方面的研究和应用。介于GCN良好的透光性质，在核酸分子线路核心成分中引入光断裂基团，即可以实现纳米孔对核酸分子线路反应过程的原位跟踪和表征，进一步提升纳米孔在动力学和原位分析中的应用潜力。 

图3. a)紫外光调控的3way-CHA单体组装示意图。b)光控3way-CHA组装过程的荧光动力学曲线。c-e)电流信号记录及相应时间窗口内的事件统计图。 

小结

作为常用的有机溶剂，甲酰胺等物质对蛋白质分子的生物相容性较低，这是该降噪方法的主要应用限制，期待在后续研究中进行改良。尽管如此，在前期工作中（Sci. Rep. 2016, 6, 36605），作者已经验证甲酰胺对DNA反应（尤其是核酸分子线路等组装反应）聚有良好的相容性，甚至是促进作用。因此，目前该降噪方法有望广泛应用于核酸，以及有机分子和聚合物的相关研究当中。 

参考文献

ZhentongZhu, et al. Low-Noise Nanopore Enables In-Situ and Label-Free Tracking of aTrigger-Induced DNA Molecular Machine at the Single-Molecular Level J. Am.Chem. Soc.

DOI: 10.1021/jacs.0c00029

https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.0c00029