同位素¹³C标记的4-羟基脯氨酸的生物合成方法

• 摘要：

  同位素13C标记的4-羟基脯氨酸的生物合成方法,它涉及4-羟基脯氨酸的合成方法.它解决了现有制备4-羟基脯氨酸的方法不适用于合成13C标记的4-羟基脯氨酸的问题.方法:一、对指孢囊菌中编码L-脯氨酸的4-羟基化酶的基因phy-1的原始序列进行密码子优化,获得优化的phy-1基因;二、优化的phy-1基因与pET19分别进行双酶切,构建原核表达载体,转入大肠杆菌中进行蛋白高效表达及纯化;三、纯化后的L-脯氨酸的4-羟基化酶进行酶反应,纯化后即完成.本发明实现了13C标记的4-羟基脯氨酸的制备,纯化过程简单,成本低,并且所得13C标记的4-羟基脯氨酸的纯度达99.99％,回收产率为75.34％.

• 专利类型：

  发明专利

• 申请/专利号：

  CN201010183169.7

• 申请日期：

  2010.05.26

• 公开/公告号：

  CN101864436A

• 公开/公告日：

  2010-10-20

• 发明人：

  姜巨全 李士龙 徐伟慧 王志刚 于丁

• 申请人：

  东北农业大学

• 主分类号：

  C12N15/53(2006.01)I

• 主权项：

  同位素13C标记的4-羟基脯氨酸的生物合成方法,其特征在于同位素13C标记的4-羟基脯氨酸的生物合成方法按以下步骤进行:一、对指孢囊菌中编码L-脯氨酸的4-羟基化酶的基因phy-1的原始序列进行密码子优化,获得优化的phy-1基因;二、优化的phy-1基因与经改造的原核表达载体pET19分别经NdeI和BamHI进行双酶切,回收所需目的片段,连接并构建原核表达载体pET19-pp-histag-phy-1,然后RNA聚合酶插在DE3上的大肠杆菌C41中进行蛋白高效表达及纯化,获得纯化后的L-脯氨酸的4-羟基化酶;三、纯化后的L-脯氨酸的4-羟基化酶进行酶学合成反应,生成反应产物,然后进行纯化,获得13C标记的4-羟基脯氨酸,即完成同位素13C标记的4-羟基脯氨酸的生物合成;其中步骤三中酶学合成反应的体系由480mM的MES缓冲液、24mM的13C标记的L-脯氨酸、48mM的2-酮戊二酸、12mM的硫酸亚铁、24mM的L-抗坏血酸和1.2mg/mL纯化后的L-脯氨酸的4-羟基化酶组成;步骤三中酶学合成反应的温度为35℃,pH值为6.5.