一种应用微载体培养Vero细胞制备基因缺失减毒疫苗的方法

• 摘要：

  本发明涉及一种应用微载体培养Vero细胞制备基因缺失减毒疫苗的方法,包括以下步骤:S1、敲除单纯疱疹病毒Ⅰ型的UL5基因,制备BAC-HSV-△UL5质粒;S2、制备表达UL5蛋白的Vero细胞;S3、微载体扩增培养S2所述的表达UL5蛋白的Vero细胞;S4、制备病毒悬液;S5、将S4制备的病毒悬液添加到S3中应用微载体培养的培养基中;S6、收集培养液上清,过滤,得病毒液;S7、病毒液加入冻干保护剂,制成疫苗.本发明提供的方法可以实现工业大规模生产高质量的单纯疱疹病毒Ⅰ型UL5基因缺失减毒疫苗,同时,本发明制备的疫苗可以安全有效的激活人体的免疫应答,降低疱疹病毒对人体的感染.

• 专利类型：

  发明专利

• 申请/专利号：

  CN201511007007.7

• 申请日期：

  2015.12.30

• 公开/公告号：

  CN105597095A

• 公开/公告日：

  2016-05-25

• 发明人：

  王一飞 任哲 方思南 廖晓凤 王巧利

• 申请人：

  暨南大学

• 主分类号：

  A61K39/245(2006.01)I,A,A61,A61K,A61K39

• 分类号：

  A61K39/245(2006.01)I,A61P31/22(2006.01)I,C12N7/00(2006.01)I,C12N15/869(2006.01)I,C12N5/10(2006.01)I,C12N5/02(2006.01)I,C12R1/93(2006.01)N,A,C,A61,C12,A61K,A61P,C12N,C12R,A61K39,A61P31,C12N7,C12N15,C12N5,C12R1,A61K39/245,A61P31/22,C12N7/00,C12N15/869,C12N5/10,C12N5/02,C12R1/93

• 主权项：

  一种应用微载体培养Vero细胞制备基因缺失减毒疫苗的方法,其特征在于,包括以下步骤:S1、敲除单纯疱疹病毒Ⅰ型的UL5基因,制备单纯疱疹病毒Ⅰ型UL5基因缺失质粒,即BAC‑HSV‑△UL5质粒;S2、构建pcDNA3.1‑UL5真核表达质粒并转染到Vero细胞,使Vero细胞表达UL5蛋白,制备表达UL5蛋白的Vero细胞;S3、微载体扩增培养S2所述的表达UL5蛋白的Vero细胞;S4、将S1所述的BAC‑HSV‑△UL5质粒转染至不加微载体常规培养的表达UL5蛋白的Vero细胞中,3‑5天后观察到细胞有病变并且出现空斑,再收集细胞反复冻融获得病毒悬液;S5、将S4收集的病毒悬液按病毒感染复数MOI为0.001:1的量接种病毒到S3中应用微载体培养的表达UL5蛋白的Vero细胞培养基中;S6、收集S5中的培养液上清,过滤,得病毒液;S6、病毒加入冻干保护剂,制成疫苗;所述单纯疱疹病毒Ⅰ型UL5基因敲除制备BAC‑HSV‑△UL5质粒的方法包括以下步骤:1)制备UL5同源重组片段UL5‑Kam‑sacB;2)将UL5‑Kam‑sacB基因片段转染至含有BAC‑HSV‑1质粒的大肠杆菌中,经卡那霉素挑单克隆筛选出插入了UL5‑Kam‑sacB基因片段的大肠杆菌;3)鉴定UL5成功敲除的菌落,提取BAC‑HSV‑△UL5质粒.