一种构建TAL效应子和TALENs的简化方法及质粒

• 摘要：

  本发明公开了一种构建TAL效应子和TALENs的简化方法及质粒,具体是通过研究发现dTALE的半个重复(LHR)是可以省略的,因而设计并构建了一个通用的RAR质粒pSK-RAR-U.由于通用RAR质粒pSK-RAR-U能够接受任何一个通过单元装配法组装的dTALE重复区,进而构建dTALEs表达载体的方法简化为:第一步为dTALE重复区序列组装,第二步为将dTALE重复区序列克隆到pSK-RAR-U中.本发明优点是为dTALEs和TALENs的构建提供了更简便的方法,节约时间和成本.

• 专利类型：

  发明专利

• 申请/专利号：

  CN201410032382.6

• 申请日期：

  2014.01.23

• 公开/公告号：

  CN103805624A

• 公开/公告日：

  2014-05-21

• 发明人：

  赵开军 王春连 郑崇珂 张晓平 王福军 秦腾飞

• 申请人：

  中国农业科学院作物科学研究所

• 主分类号：

  C12N15/66(2006.01)I,C,C12,C12N,C12N15

• 分类号：

  C12N15/66(2006.01)I,C12N15/63(2006.01)I,C12N15/74(2006.01)I,C,C12,C12N,C12N15,C12N15/66,C12N15/63,C12N15/74

• 主权项：

  一种通用载体pSK‑RAR‑U的构建方法,其特征在于,包括以下步骤:第一步,以含有avrXa23基因的pBluescript SK+质粒即pSK‑avrXa23质粒DNA为模板,分别用引物对TalenF1/TalenR1、TalenF2‑U/TalenR2进行PCR扩增,将扩增出的两个PCR产物混合作模板,再用引物对TalenF1/ TalenR2进行搭桥PCR;第二步,将扩增出的片段回收,与pEASY‑Blunt载体重组连接,测序正确的克隆用SphI酶切;第三步,将酶切片段克隆到中间载体pSK‑avrXa23ΔSphF‑XH载体,构建成通用的重复可变区受体质粒载体,命名为pSK‑RAR‑U;其中,所述TalenF1、TalenR1、TalenF2‑U、TalenR2的序列分别是SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.15;其中,所述中间载体pSK‑avrXa23ΔSphF‑XH载体构建方法如下:(1) 将(pSK‑avrXa23用SphI酶切,去除SphI酶切的DNA片段,将含有avrXa23的N端和C端DNA序列的载体在T4连接酶作用下自连,形成的载体命名为pSK‑avrXa23ΔSphF,其中avrXa23没有SphI片段;(2) 用引物avrXa23F6和avrXa23R6,以pSK‑avrXa23ΔSphF载体为模板进行PCR扩增,扩增片段重组到pBluescript II SK的SmaI酶切线性DNA上,形成的中间载体即为pSK‑avrXa23ΔSphF‑XH;所述引物avrXa23F6和avrXa23R6的序列分别为SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5.