Nature细读：“神器”横空出世，3D肿瘤细胞培养更适用于癌症研究

来源：iNature

癌症是一种慢性的基因疾病，主要是由正常体细胞发生基因突变而导致。在肿瘤恶性转化和生长的过程中，有一小部分突变会促进促进肿瘤生长和恶性转化，被称为驱动突变（driver mutations）；而另一部分对细胞健康无害的突变，被称为乘客突变（passengers）。有关于癌症基因突变的大量研究已为我们提供了很多的信息，从癌症预测，到诊断，再到预后多起到了很大的帮助。但是，人们依旧不清楚哪些突变是功能性癌症的驱动因素。因此，在相关癌症模型中高通量大规模研究这些基因，实现对驱动突变和乘客突变的分类，进一步识别基因组突变的“actionability“（可诉性）是癌症研究最迫切的需求。

现有的体外和体内模型对于确定癌症的生物学特性都有着极佳的效果，但每种模型都有其局限性。其中，基因工程小鼠模型涵盖了肿瘤生长和微环境的变化，但受到量化成本高的限制；基于异种移植的模型在通量小，并且在体外很难操作；肿瘤生长和药物敏感性的研究在很大程度上依赖于体外单层肿瘤模型（2D cell culture），这种模型缺乏许多疾病的特征，如缺氧、细胞间接触的改变和新陈代谢的改变；3D细胞培养缓解了其中的一些担忧，但是想实现高通量仍是一个很大的挑战。开发一种可高通量制备的3D肿瘤模型，以全基因组测序的方式来研究驱动基因的可诉性是迫在眉睫的。 

目前3D细胞培养大致分为两类：基于支架的和无支架的。常见的3D细胞培养支架是由细胞外基质形成的水凝胶（Hydrogels），很多3D 类器官都采用水凝胶支架培养。不依赖支架的 3D 细胞培养是指用超低细胞粘附板（通常96孔）、悬滴法、旋转培养法或磁力悬浮法让细胞形成3D球体。该研究以第一种方法为主，优化了甲基纤维素的浓度和接种细胞的密度，更利于3D肿瘤球的形成与生长。

来自美国斯坦福大学医学院的 Michael C. Bassik教授团队在Nature 发表了题目为“CRISPR screens in cancer spheroids identify 3D growth-specific vulnerabilities”的文章，通过可高通量制备的肺癌类器官模型，使用全基因组CRISPR筛查，为我们更进一步解析了2D模型和3D模型之间差异，如突变的频率和驱动基因的富集程度，并建立了在3D肿瘤模型中进行CRISPR筛选来揭示癌症弱点的通用策略。

筛选思路（图源自Nature ）

在2D肿瘤模型中通过CRISPR筛查已经可以得到丰富的信息，但是他们往往不是复制肿瘤生物学的关键方面，并且在2D培养过程中已知肿瘤抑制基因的表型为阴性。因此，作者以肺腺癌细胞系H23为研究对象，通过调整外基质中甲基纤维素的浓度以及单孔细胞接种密度实现高通量构建3D肺癌肿瘤模型。由于H23细胞本身含有KRAS（G12C）突变，利用CRISPR结合ARS-853（KRAS抑制剂）对2D和3D肺癌肿瘤模型进行筛选，结果表明，3D肺癌肿瘤模型的表型更接近真实癌组织，多为正生长表型，而反观2D模型则多为负表型。

与此同时，对两种模型进行更进一步的通路富集分析，3D肺癌模型以p53和RAS（H23细胞已知的驱动因素）等癌症特异性通路富集为主。2D模型则是以常见的基本细胞功能通路富集为主，如DNA复制。这可能是因为这些驱动基因控制着模型向更具侵略性的3D生长的过渡过程，这是肿瘤发生的标志。其中可能包括与细胞黏附有关的基因或能够响应球体中“类肿瘤”应激（例如缺氧或细胞拥挤）的基因。总而言之，这些数据表明，3D模型能够更准确地捕捉到癌症基因和通路的特征。

为了更系统地比较2D模型、3D模型与肿瘤异种移植模型之间的差异，研究者们建立一个由911个具备生长效应的前体分子构成的sgRNA库，并以此对2D模型、3D模型与肿瘤异种移植模型进行比较。提出了更优的用于体内CRISPR筛选的方案，该方法可以从肿瘤异种移植物中获得了高度可重复的数据。值得注意的是，来自3D模型的基因表型与小鼠异种移植中的基因表型比来自2D模型的基因表型更紧密相关。准确的肿瘤功能缺失表型体外建模可能成为治疗策略个性化的重要手段，例如CREBBP抑制剂已经被用于治疗各种癌症。然而，在这里测试的某些肺癌株中，CREBBP基因敲除对2D癌症模型生长有负面影响，但对3D模型和小鼠异种移植模型的生长有积极影响。