NCB | 刘志杰/陈丽珍团队打开肿瘤细胞可塑性和耐药性的“黑匣子”

来源：BioArt

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肿瘤恶化过程伴随的细胞可塑性以及耐药性一直是人类攻克肿瘤的一大障碍。在各种不同肿瘤里，乳腺癌是一个很好的研究肿瘤细胞可塑性以及耐药性的对象。据最新发表于CA Cancer J Clin杂志的美国癌症数据统计，乳腺癌仍然是女性恶性肿瘤相关性死亡的主要原因【1】。乳腺癌是一类在分子水平上高度异质性的肿瘤，根据雌激素受体（Oestrogen receptor，ER）、孕激素受体（Progesterone receptor，PR）和表皮生长因子受体2（Epidermal growth factor receptor 2, HER2） 的表达水平，乳腺癌分为4 种分子亚型: Luminal A 型、Luminal B 型、HER2 过表达型和Basal-like型。其中，70%~80%乳腺癌为雌激素受体阳性表达，因此，内分泌治疗（Endocrine therapies）已成为激素敏感型（Hormone-sensitive）乳腺癌的主要并且有效的治疗方式，是与手术、化疗、放疗并驾齐驱的重要治疗手段。

目前，临床上常用的内分泌疗法包括：选择性ER拮抗剂他莫昔芬（Tamoxifen）、用于阻断雌激素合成的芳香酶抑制剂（Aromatase inhibitor）和选择性ER降解剂氟维司群（Fulvestrant）。尽管内分泌疗法能够抑制早期乳腺癌的复发，以及减缓转移性疾病（Metastatic disease）的发展进程。然而，三分之一的ER阳性乳腺癌患者在接受上述药物治疗之后仍会出现复发（Relapse）的现象，而且复发的癌细胞在雌激素缺乏的条件下依旧能够生长，从而导致耐药性的产生。内分泌耐药主要分为原发性耐药（De novo resistance）和继发性耐药（Acquired resistance）两类。继发性耐药的分子生物学机制仍然不清楚，可能与信号通路的异常调控、遗传学改变的累积、表观遗传学的调控失常等多方面相关。目前，继发性耐药问题仍是导致激素受体阳性乳腺癌患者的疾病恶化和死亡的主要原因之一，也是现今内分泌治疗的困境和亟待解决的主要难点之一。因此，研究内分泌疗法的耐药机制对更加科学合理的用药以及新的治疗方案设计都具有重要的意义。

在发育和其它许多生物学过程中，增强子（Enhancer）是调控细胞基因时空特异性表达关键的顺式作用元件。增强子功能失调涉及许多疾病，包括癌症。各种转录因子（Transcription factors, TFs）结合到增强子上从而引发染色质重塑酶的招募，最终导致开放的染色质和邻近核小体上特殊模式的组蛋白修饰，包括H3K27ac 和H3K4me1。许多增强子结合RNA聚合酶II并被活跃地转录，产生非编码增强子RNA（eRNA）。eRNA被广泛用于指示增强子的活性和靶基因的诱导。我们之前的染色质免疫共沉淀技术（ChIP-seq）研究显示， 激素受体ER主要通过结合在远端增强子上来调节目标基因的表达，进而调控细胞生长和内分泌反应【2,3】。大量临床试验表明ER仍然是乳腺肿瘤内分泌治疗耐药的关键驱动者。在乳腺肿瘤中，不同的ER染色质结合模式和不同的临床结果相关联【4】。然而，我们对ER调节内分泌治疗耐药和乳腺癌恶化进程的精确分子机制尚不完全清楚。

2020年5月18日，美国德州大学圣安东尼奥健康医学中心的科研团队在Nature Cell Biology杂志上在线发表了题为“Enhancer reprogramming driven by high-order assemblies of transcription factors promotes phenotypic plasticity and breast cancer endocrine resistance”的研究论文，该工作通过大量组学（omics）技术首次发现并系统地阐述了致癌转录因子GATA3和AP1协同调控增强子重塑，从而促进ER阳性乳腺癌细胞表型可塑性和内分泌治疗耐药的新机制【5】。毕明君博士和张钊博士为文章的共同第一作者，刘志杰博士和陈丽珍博士为文章的共同通讯作者。这项研究还同时得到其它美国、法国、以及中国上海的几个科研单位的鼎力支持。

据悉，该论文受到了编辑和审稿人的高度评价，Nature Cell Biology杂志编辑还邀请了来自美国冷泉港实验室的领域内专家Christopher Vakoc和他的博士研究生吴小丽在同一期中做了题为“A pliable ERα cistrome evades therapy”的点评。这篇论文也是刘志杰／陈丽珍团队延续他们最近的增强子研究成果 （详见BioArt报道：Mol Cell | 刘志杰/陈丽珍等发现Hippo通路在增强子激活和基因表达中的非经典功能）之后又一个重要发现。

在该项研究中，研究人员首先利用RNA-seq和GRO-seq对经典ER+乳腺癌细胞系MCF7和经过长期Tamoxifen培养获得的抗性细胞进行转录组的比较，发现表皮分化相关的基因在抗性细胞中显著下调而上皮间质转化（Epithelial-mesenchymal transition, EMT）和侵袭转移相关的基因显著上调，但是抗性细胞并没有进行完全的EMT转化，而是处于Hybrid Epithelial/Mesenchymal Phenotypes （这种肿瘤细胞可塑性现象在很多不同肿瘤的恶化过程中都曾被发现过）。最新的研究也证实处于Hybrid状态的肿瘤细胞最具侵袭性和药物治疗抗性【6】。作者进一步对21位ER+乳腺癌病人接受联合化疗和内分泌治疗前后的样本，以及激素敏感和抗性的PDX模型样本分别进行转录组分析比较，证实了增强表型可塑性的转录组改变与内分泌治疗抗性密切相关。

为了进一步寻找转录组变化的原因，研究人员利用ChIP-seq和ATAC-seq，发现一大群增强子在抗性细胞系中丢失（LOSS enhancers），而另一群增强子却重新获得（GAIN enhancers），并且这些增强子的改变显著与附近基因的表达变化正相关。作者进一步发现这些变化的增强子大部分依然被雌激素受体占据，并且GAIN enhancers附近的基因显著富集EMT和干细胞维持相关通路，暗示增强子的变化可能导致表型可塑性的增强以及抗性的获得。

多个转录因子的组合相互作用可以调节特定背景下的增强子激活，通过生信分析和细胞学实验，发现LOSS enhancers富集 GATA3和FOXA1 motif，而且GATA3的蛋白表达水平在抗性细胞中显著降低；而GAIN enhancers 富集AP1和FOXA1 motif，并且JUN（AP1复合体核心成分）的磷酸化水平显著上升。BioID质谱分析表明抗性细胞GATA3和ER相互作用明显减弱，JUN 和ER相互作用显著增强。有意思的是，在LOSS和GAIN enhancers中，ER的motif并不富集，但是ER的结合依然很高，作者推测ER通过一种不依赖于特定DNA序列而是依赖于蛋白质-蛋白质相互作用的模式结合到这些增强子上发挥作用。通过构建ER蛋白DNA结合结构域突变的细胞系以及ChIP-qPCR实验，作者证实了这种猜想，在经典ER直接结合增强子区，突变体ER不能有效结合，但是在依赖蛋白质-蛋白质相互作用的增强子位点，突变体依然能够结合很强。通过GATA3和JUN的ChIP-seq实验发现，这些LOSS和GAIN的增强子区域确实被GATA3或JUN结合，提示GATA3或 JUN对于这些增强子区域的维持或者重塑具有重要作用。

作者进而在MCF7细胞系中敲低GATA3表达，发现在LOSS enhancers区H3K27ac和ER信号以及这些增强子附近的基因表达水平显著下降；相反，如果在抗性细胞系中过表达GATA3，这些LOSS enhancers区域的H3K27ac信号以及基因表达水平显著增强。对于GAIN enhancers区域，在MCF7中过表达JUN，发现这些区域的H3K27ac和ER信号以及附近的基因表达显著增强，而在抗性细胞中敲低JUN会导致相反的效应。令人惊奇的是，操作GATA3不仅对LOSS enhancers具有强烈的作用，对GAIN enhancers也有一定的作用，作者推测GATA3作为主要的腔状上皮细胞转录因子具有很强的限定作用，会掠夺细胞中核心转录资源进而抑制其它转录因子的功能，通过竞争实验发现，GATA3对ER的结合明显强于JUN，具体机制以及是否对其它因子具有竞争作用有待进一步研究。这个研究也同时揭示了转录因子-转录因子、转录因子-表观因子的复杂相互作用在决定增强子活性和功能中起着决定性作用。

基于GATA3 和AP1 对GAIN enhancers 的相反作用，作者进一步猜想同时失活GATA3并且激活AP1是否会导致更强的增强子重塑。事实上，在MCF7细胞系中，同时敲低 GATA3 和过表达JUN会比单独操作导致LOSS和GAIN enhancers区H3K27ac信号更强烈地向抗性细胞转变，并且基因表达以及细胞形态变化也更加类似于抗性细胞。作者也在另外两个ER+细胞系T47D和ZR75-1中证实了这一协同作用。为了进一步在体内确定这一发现，作者构建了xenograft小鼠模型，发现同时敲低 GATA3和过表达JUN会导致肿瘤细胞更加耐受tamoxifen以及更大的肿瘤。

综上所述，该研究证明在ER+乳腺癌的内分泌治疗耐受发展过程中，大量的增强子发生了重塑，并且这些变化是由复杂的转录因子以及其他因子的组合失调所导致，进而影响了细胞表型的可塑性以及导致药物耐受的发生。同时，该研究指出相对于传统的靶向单个转录因子或其它蛋白的治疗，对多个转录因子的综合操作对于内分泌耐受病人的治疗具有重要的指导意义。

原文链接：

https://doi.org/10.1038/s41556-020-0514-z

参考文献

1. Siegel, et al. Cancer Statistics, 2020. CA Cancer J Clin 2020; 70:7–30

2. Liu, et al. Enhancer activation requires trans-recruitment of a mega transcription factor complex. Cell 159, 358–373 (2014).

3. Zhu, et al. A non-canonical role of YAP/TEAD is required for activation of estrogen-regulated enhancers in breast cancer. Mol. Cell 75, 791–806 e798 (2019).

4. Ross-Innes, et al. Differential oestrogen receptor binding is associated with clinical outcome in breast cancer. Nature 481, 389–393 (2012).

5. Bi, et al. Enhancer reprogramming driven by high-order assemblies of transcription factors promotes phenotypic plasticity and breast cancer endocrine resistance.  Nature Cell Biology, 2020

6. Gupta, et al. Phenotypic plasticity: driver of cancer initiation, progression and therapy resistance. Cell Stem Cell 24, 65–78 (2019).