一步法修饰纸表面以捕获DNA探针：其方法、机理、及应用学术资讯

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近日，美国德克萨斯大学埃尔帕索分校（The University of Texas at El Paso, UTEP）的李秀军（XiuJun Li）团队报道了一种简单、通用、低成本的一步法用于纸的表面修饰以固定DNA探针，实现了方便、快捷、高效的纸芯片基因微阵列（paper-based DNA microarray）。该团队系统进一步研究了DNA分子在纸表面的固定机理，并应用于对病原体（Giardia lamblia）的快速、灵敏、低成本的检测。
基因微阵列（DNA microarray）或基因芯片技术在很多领域，尤其是疾病诊断，发挥了重要的作用。传统的基因芯片主要依赖于玻片载体，通过对玻片的修饰，核酸探针将以共价键或非共价键的作用固定在玻片表面，从而实现对目标核酸的检测。然而，玻片载体的表面修饰离不开危险性化学清洗溶液（例如piranha solution），昂贵的专业设施（例如cleanroom），而且处理过程通常比较复杂，且成本高、耗时长，极大地限制了其在即时检测（POCT）中的应用。因此，许多科研工作者致力于研发简单、快捷、低成本的基因芯片载体。近年来，纸芯片因具有独特的三维多孔结构和较低的制作成本，受到众多研究者的青睐。以纸芯片为载体的基因分析技术在环境监测、食品安全监控、即时检测等许多领域都有较好的应用前景。然而，这些方法通常利用多步交联反应（cross-linking reaction）固定生物分子或探针，并依赖于对生物分子（例如DNA）的功能化修饰（胺基、巯基等），阻碍了其更加广泛的应用。
为解决以上问题，李秀军团队研发了一种简单、通用、低成本的一步法，用于修饰纸表面并捕获无需功能化的核酸探针（图1）。此方法的设计基于以下设想：利用纸表面的羟基与APTMS（3-aminopropyl trimethoxysilane）的三乙氧基硅烷反应，引入质子化的胺基，因此导致纸表面带正电；此外，由于DNA探针分子的磷酸基团带有负电荷，探针分子将通过静电吸引作用固定在APTMS修饰过的纸上，通过DNA分子杂交，目标物（Cy3标记）将被分析检测。为验证这一设想，作者采用了多种表征手段，分别验证APTMS修饰过程和DNA分子固定过程。首先，通过对比未修饰的纸，修饰过的纸与常用的荧光探针（荧光素）反应导致荧光增强约30倍，证明了APTMS修饰之后，大量胺基存在于纸表面。其次，X射线光电子能谱分析（XPS）和红外光谱分析（FT-IR）证明了对纸表面修饰后，胺基的引入有利于DNA分子在纸上的固定。

图1. 一步法修饰的纸表面通过离子吸附原理固定并检测DNA。
为进一步探究DNA分子在纸上的捕获机理，作者研究了不同pH体系对DNA在纸上的固定效率的影响。实验发现（图2A-B），DNA固定效率取决于不同pH下，两个因素的相互作用：纸表面质子化胺基的正电荷与DNA分子磷酸基团的负电荷。在pH大于胺基pKa（11.0）时，纸表面的正电荷减少，且占主导作用，不利于DNA固定，因此pH越高，DNA固定效率越低。另一方面，pH小于11.0时，纸表面保持正电，DNA固定效率取决于磷酸基团的负电荷的多少，由于磷酸根的pKa（2.1、7.2、12.5）值分别对应不同的离子（H2PO4−、HPO42−、PO43−），因此pH越高，在纸上固定的DNA分子越多。在pH（7.0-11.0），DNA的固定效率达到最大值，为最优pH条件。此结果也验证了此方法的机理：DNA分子是通过异电荷离子吸附作用固定在APTMS修饰的纸上。

图2. 利用一步法修饰的纸固定DNA分子的机理研究及应用。（A）不同pH对DNA分子在纸上固定效率的影响，以及（B）纸表面和DNA分子的电荷、离子存在形式随pH的变化。（C）一步法修饰的纸芯片，（D）及其在定量检测病原体DNA的应用。
此外，通过对比分析不同基因芯片载体（纸和玻片），以及不同表面修饰方法（一步修饰法和常用的多步交联反应修饰法），该研究证明了纸载体在固定DNA时优于传统的玻片载体，单次检测成本由$18降至$0.06。而且，对比多步交联反应修饰方法，一步修饰法无需复杂、耗时（3 h vs 0.5 h）的步骤，以及对DNA分子的功能化，即可获得相同水平的DNA纸上固定效率。通过此方法，修饰后的纸芯片被应用于特异性检测食源性贾第虫病原体（图2C-D），检测范围在10-1000 nM，检测限为22 nM，从而实现了通用（无需对DNA探针分子特定功能化修饰）、快速（检测时间缩短至1/6）、灵敏（灵敏度提至30倍）、低成本（成本降至1/300）的定量DNA检测。鉴于DNA探针、DNA适配体在生物分析中的广泛使用，该方法将为纸芯片在基因分析检测，尤其是疾病和病原体的即时检测方面，提供广阔的应用前景。

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