从胞嘧啶到腺嘌呤，从单碱基到双碱基：碱基编辑器的演化之旅

来源：生物通
哈佛大学著名的David Liu实验室在2016年利用Cas9融合蛋白开发出单碱基编辑器，能够大大提高碱基编辑的效率。自此，研究人员不断开发碱基编辑工具，可在动物、植物和微生物中实现点突变。

胞嘧啶碱基编辑器的示意图（图片来自Addgene）

人类的许多遗传病是由基因组中的突变引起的。因此，科学家在不断寻找工具去编辑或修复遗传代码中的这些错误。CRISPR/Cas9便成为最有希望的技术之一。利用这把“剪刀”，研究人员能够改变或删除某个基因。然而，CRISPR的应用也面临一个问题，那就是同源定向修复（HDR）的编辑效率太低。

为了应对这一问题，哈佛大学著名的David Liu实验室在2016年利用Cas9融合蛋白开发出单碱基编辑器，能够大大提高碱基编辑的效率。自此，研究人员不断开发碱基编辑工具，可在动物、植物和微生物中实现点突变。如今，碱基编辑已经广泛应用于基础研究、合成生物学和作物改良，引起了学术界和工业界的极大兴趣。

早期的碱基编辑器

David Liu实验室最初利用大鼠的胞苷脱氨酶APOBEC1和dCas9创建出第一代的碱基编辑器（BE1），能够将胞嘧啶（C）转化成尿嘧啶（U），从而实现C→T（或G→A）的碱基替换1。BE1表现出约5个核苷酸的活性窗口，从第4位到第8位。不过，在转移到细胞培养模型之后，他们发现编辑效率从44%陡降至0.8-7.7%，这可能是由于尿嘧啶DNA糖基化酶（UNG）参与了碱基切除修复，去除了DNA中的尿嘧啶。

于是，他们就开发出第二代的BE2系统，将尿嘧啶糖基化酶抑制剂（UGI）与dCas9相融合，从而将编辑效率提高了三倍，最高达到20%。对于BE1和BE2，由于DNA并非直接切割，因此插入缺失的形成非常少（< 0.1%）。

为了让碱基编辑的效率提高到50%以上，你需要将编辑复制到另一条DNA链上。为此，研究人员将dCas9变身为切口酶，以便模拟错配修复。BE3在未修饰的DNA链上产生切口，使它看起来像是新合成的。因此，细胞以含有尿嘧啶的链作为模板来修复DNA，并复制碱基编辑。

通过这种方式，BE3系统将各种靶点的编辑效率提高到30%以上，且插入缺失的频率仅为1.1%。这与Cas9介导的HDR相比是巨大的进步，因为HDR介导的编辑效率仅为0.5%，而且观察到多个插入缺失。不过，此系统也会带来脱靶效应，主要来自Cas9脱靶，而不是APOBEC1。

第三代编辑器的改进

日本神户大学Akihiko Kondo领导的团队随后进一步证实了碱基编辑的实用性2。他们将来自海鳗的胞苷脱氨酶与Cas9切口酶相融合，创建了Target-AID碱基编辑器。它的作用方式与BE3类似，但又不完全相同，其编辑窗口位于PAM上游18个碱基处的3-5个碱基。

David Liu实验室在2017年也生成了带有其他脱氨酶的BE3变体，包括AID、CDA1和APOBEC3G。他们发现，CDA1-BE3和AID-BE3能够比BE3更有效地编辑G后面的C，而APOBEC3G表现出较少的序列偏好。这些结果表明，特定的脱氨酶以及与Cas9的连接方式会影响编辑的作用和效率3。

之后，David Liu实验室的研究人员将重点又放在Cas9上。他们利用天然和改造的Cas9变体开发出五种PAM序列不同的碱基编辑器，从而扩大了碱基编辑的目标范围4。对于每种碱基编辑器，他们观察到的最低编辑效率约为50%，并确认融合蛋白保留了Cas9的PAM特性。他们还诱变了碱基编辑器的胞苷脱氨酶部分，产生了SpCas9碱基编辑器，其编辑窗口小到只有1-2个核苷酸。

为了减少与碱基编辑相关的脱靶效应，研究人员又建立了高保真版的BE3系统5，这个碱基编辑器采用了高保真的Cas9变体——HF-Cas9。随后，他们利用容易脱靶的gRNA来测试原始的BE3和HF-BE3。他们发现，HF-BE3的脱靶编辑比BE3低了37倍。为了进一步提高特异性，他们纯化了HF-BE3蛋白，并以核糖核蛋白颗粒（RNP）形式导入斑马鱼胚胎和小鼠内耳。

第四代的碱基编辑器

研究人员观察到，以BE3为基础的系统不仅仅会产生C→T，还会产生C→G或C→A。他们假设，这些副产物是由于尿嘧啶DNA糖基化酶（UNG）切除尿嘧啶而产生的。于是，David Liu实验室在BE3的基础上，融合了第二个拷贝的UNG抑制剂，以提高碱基编辑产物的纯度。自此，第四代碱基剪辑器BE4产生。与BE3相比，BE4的C→G和C→A产物减少了2.3倍3。

为了进一步降低插入缺失的产生，David Liu领导的研究团队将噬菌体蛋白Gam融合到BE4的N端。Gam蛋白与双链断裂的游离端结合，可能导致细胞死亡，而不是NHEJ修复，从而将修复细胞从编辑细胞中剔除。因此，Gam与BE4或SaBE4的融合使得插入缺失的频率降低1.5-2倍。

腺嘌呤碱基编辑器

以往的碱基编辑大多限于C→T的转换，或另一条链上G→A的转换。是否能够对其他碱基进行编辑？还是David Liu实验室，他们在2017年开发出一个腺嘌呤碱基编辑器，将腺嘌呤转化成肌苷，从而实现A→G的转换。由于没有已知的DNA腺嘌呤脱氨酶，他们便通过定向进化从RNA腺嘌呤脱氨酶TadA中产生。

经过七轮的分子进化，研究人员获得了四种腺嘌呤碱基编辑器（ABE）6。ABE7.10是活性最高的编辑器，在目标位置4-7的编辑窗口内显示出平均53%的编辑效率。ABE 6.3、7.8和7.9则显示出较宽的编辑窗口。与CBE不同，ABE不会在目标位点处出现A到其他碱基的转换。他们认为从DNA中去除肌苷的可能性比较小，从而阻止了碱基切除修复。

改进改进再改进

当然，任何碱基编辑器都不是完美的，于是研究人员开启了漫长的改造之旅。2018年，David Liu实验室在《Nature Biotechnology》杂志上发表文章，显示表达水平是碱基编辑效率的一个瓶颈。他们通过修饰核定位信号（NLS）和密码子使用以及脱氨酶组分的重构来优化胞嘧啶（BE4）和腺嘌呤（ABE7.10）碱基编辑器。此次产生的BE4max、AncBE4max和ABEmax编辑器可以在各种类型的哺乳动物细胞中纠正致病性SNP，并大大提高效率7。

在碱基编辑这一领域，中国学者也发表了大量成果。2018年，中科院遗传与发育所的研究人员在前期研究基础上利用Cas9变体（nCas9-D10A）融合人类胞嘧啶脱氨酶APOBEC3A（A3A）和尿嘧啶糖基化酶抑制剂（UGI），构成新的单碱基编辑系统A3A-PBE，成功在小麦、水稻及马铃薯等植物中实现比PBE更加高效的C→T单碱基编辑8。

不久前，华东师范大学的李大力和刘明耀课题组在《Nature Biotechnology》杂志发表了一种全新的双碱基编辑器。他们将人类胞嘧啶脱氨酶、腺嘌呤脱氨酶和Cas9切口酶融合在一起，开发了腺嘌呤和胞嘧啶的双碱基编辑器A&C-BEmax，它可以在同一等位基因的靶序列上实现C→T和A→G的高效转换9。

至于双碱基编辑器，同期《Nature Biotechnology》杂志上还发表了麻省总医院的另一项成果。J. Keith Joung 团队将腺苷脱氨酶（TadA）、来源于七鳃鳗的胞嘧啶脱氨酶（PmCDA1），分别融合到Cas9切口酶的N端和C端，开发出一种双碱基编辑工具SPACE（Synchronous Programmable Adenine and Cytosine Editor），可以同时引入A→G和C→T替代10。