造血干细胞基因编辑策略更新！效率更高，适用更广

来源：BioArt

造血干细胞（HSCs）靶向基因编辑是一种很有前景、很有潜力的、针对多种疾病的治疗方法。它能够通过靶向基因组编辑来实现突变等位基因的原位校正、功能恢复和生理表达控制【1】。可编程核酸酶（如CRISPR/Cas）通过将位点特异性DNA双链断裂（DSBs）引入基因组来进行基因编辑【2】。DSB修复可以通过高保真同源定向修复（HDR）来实现，利用外源DNA模板进行基因校正或靶向整合。然而，HDR在HSCs中的效率不佳以及该过程对克隆组成和移植动力学的未知影响阻碍了临床应用。

2020年6月29日，来自意大利米兰的San Raffaele Telethon Institute for Gene Therapy的慢病毒载体发明人、基因治疗领域先驱Luigi Naldini团队与哈佛医学院Pietro Genovese合作在Nature Biotechnology杂志上发表题为Efficient gene editing of human long-term hematopoietic stem cells validated by clonal tracking的研究论文，这篇论文所提供的新方案改进并扩大了HSC基因编辑的适用性，为未来临床应用铺平道路。

作者采用了一种称为BAR-Seq的新策略应用于编辑细胞的克隆追踪，结果显示尽管植入编辑克隆保留了多系性和自我更新能力，这种新的编辑策略激活了p53，大大缩小了血细胞嵌合体小鼠的HSC克隆库。对p53进行瞬时抑制，恢复了多克隆移植物的组成。
作者通过腺病毒Ad5-E4orf6/7蛋白的瞬时表达，使得Ad5-E4orf6/7蛋白在其靶基因上募集了细胞周期控制因子E2F，促进细胞周期进程，上调HDR机制运转，从而提高HDR效率，迫使其进展到S/G2细胞周期阶段（图1）。E4orf6/7表达和p53抑制作用结合起来，HDR编辑效率提高高达50％，同时，还不会干扰已编辑的HSC的再增殖和自我更新。
图1. Ad5-E4orf6/7通过E2F途径促进细胞周期进程并上调HDR机制示意图
 此前已有的方案存在两个障碍：一是p53响应太过强烈，二是HDR受限。作者的新方案克服了这两个障碍，对编辑过的造血干/祖细胞（HSPCs）的克隆追踪证明了多克隆重组，并保留了单个编辑过的HSC的自我更新能力和多能性（图2），增加了人们对未来的临床应用的信心。
图2：HSPCs中的编辑策略及其结果示意图
HSPC克隆数量的大幅减少很好地解释了移植后编辑的细胞与未处理的细胞相比，人体植入率较低的原因【3】。尽管p53通路及其下游如p21、p14和p16的强烈激活提示了诸如永久性生长停滞、衰老和凋亡等有害过程的发生，但其中机制仍有待充分探索。目前作者的新方法仅限于所编辑的细胞移植物中的优势克隆，还无法对静止期和短寿命祖细胞进行研究。

HDR主要发生在S/G2期，作者的数据也表明，细胞周期调控是HSPCs中HDR编辑的限速步骤。p53抑制后，Ad5-E4orf6/7所致的HDR增加更加明显，可能是因为，通过抵消E2F激活而触发了p21和p14介导的负反馈，这种反馈也可以解释为什么Ad5-E4orf6/7没有增加标准编辑细胞的植入量。
对于p53激活所产生的有害影响来说，p53-/-细胞自带选择性优势，但这种细胞很稀有。对编辑诱导的p53响应的瞬时抑制将降低选择p53突变体克隆和单/寡克隆扩增的风险。寡克隆成分可能会延迟造血恢复，并限制工程细胞移植物的大小、长期稳定性和安全性。使用mRNA瞬时表达p53抑制剂和Ad5-E4orf6/7可以排除潜在转化因子进行基因组整合的风险。
这项研究后来还意外发现了Ad5-E4orf6/7治疗的另一个好处，即某些免疫反应/趋化因子基因下调，这可能有助于亲本病毒的免疫逃避。这种现象也可能降低HSPC的抗原呈递以及免疫效应剂招募的风险，HSPCs在编辑后不久仍含有细菌和病毒来源的免疫原性蛋白（如Cas核酸酶和AAV衣壳蛋白）。
总的来说，这套新版增强方案获得的克隆库和已编辑的HSPC百分比的增加对临床大有裨益。HDR编辑的细胞在细胞产物中的比例越高，与宿主中未编辑和残留的HSPC的竞争就越少，所获得的嵌合性就越好，从而疗效更佳。这些益处可以很好地平衡首次人体临床试验的固有风险（例如原发性免疫缺陷）。所以，HSPC基因编辑最终很可能带来非常有效的临床治疗。