关于靶向诱导蛋白降解技术的探索与研究学术资讯

来源：BioArt

靶向诱导蛋白降解技术(Proteolysis targeting chimeras, PROTAC)成为继小分子抑制剂（SMI）和单克隆抗体（mAb）药物后的又一大热门。与SMI和mAb相比，PROTAC具有独到的优势，能够靶向众多的以前被称为“不可成药”的蛋白分子。迄今已有上百种PROTAC分子已经或者正在研制当中，众多的新兴创业公司也是群雄崛起，包括国外的Arvinas（以Craig Crew为代表，其代表作为第一个进入临床试验的PROTAC分子ARV-110），C4（以Nathanael Gray和James Bradner为代表），Kymera，Vividion，Cedilla （创始人包括诺奖得主William Kaelin等），Oncopia（王少萌为代表），Cullgen（金坚为代表），而多家大药企也在跑马圈地，如诺华（James Bradner领导）、安进（Raymond Deshaies领导，详见BioArt报道：Nature | 第四次制药业革命-Raymond Deshaies院士独家综述多特异性药物）等。另外，国内也成立了多家以PROTAC为基础的初创企业，如凌科药业、分迪科技、开拓药业等。虽然相对于SMI和mAb药物，PROTAC具有独特的优势，但是也存在明显的短板。比如，PROTAC的靶点通常是胞内蛋白，而对分泌蛋白和细胞膜蛋白则束手无策。细胞膜蛋白的降解通常是通过溶酶体途经完成，如EGF引起的EGFR降解过程。因此，溶酶体降解途经也成为靶向降解膜蛋白的主要设计思路。 2020年7月29日，斯坦福大学HHMI研究员Carolyn R. Bertozzi教授在Nature杂志上发表了题为Lysosome-targeting chimaeras for degradation of extracellular proteins的文章，在文中，作者设计并验证了使用溶酶体降解途经降解胞外蛋白和细胞膜蛋白的LYTAC技术，并以EGFR，PD-L1和CD71等为例证明了LYTAC技术的可行性和特异性。该研究成为PROTAC的外延，丰富了蛋白降解途经成药的工具箱。

细胞表面的溶酶体靶向受体（lysosome-targeting receptors，LTRs）介导蛋白质向溶酶体的转运及后续的降解过程【1】。阳离子-非依赖甘露糖-6-磷酸受体（cation-independent mannose-6-phosphate receptor，CI-M6PR，又称IGF2R）是LTR的典型代表，能够将含有甘露糖-6-磷酸（mannose 6-phosphate，M6P）支链的N糖原修饰的蛋白质转运到溶酶体进行降解【2】。当CI-M6PR结合待降解的蛋白并进入溶酶体以后，溶酶体内的低PH值条件引起二者解离，蛋白底物则被溶酶体所降解，而CI-M6PR本身通过高尔基体再次转运到细胞膜循环利用【3】。以此为基础，作者设计了LYTAC系统，对分泌蛋白和细胞膜外蛋白进行靶向降解。LYTAC系统包括2个主要部分，一部分是能与LTR结合的含M6P支链的NCA聚糖肽（n=20~90），另一部分则是与待降解的底物蛋白对应的特异性抗体（图1）。因此，作者也从这两部分对LYTAC系统进行分别的设计和优化。

图1. LYTAC系统图示
首先，作者在NCA聚糖肽上连接荧光分子NA-647，检测并优化聚糖肽是否能够将货物带到溶酶体中，发现与阴性对照支链GalNAc和mannose相比，M6P和M6Pn能够有效地将货物带入细胞内，并定位于溶酶体（图1）。然后，作者通过CRISPRi筛选，确定LYTACs作用机制依赖于IGF2R、内涵体（endosome）、囊泡转运（vesicle trafficking）、内涵体-溶酶体融合以及网格蛋白（Clathrin）依赖的内吞途经等相关信号通路。此外，作者还发现胞吐体（exocyst）也至关重要，推测其参与CI-M6PR向细胞膜的呈递。使用CRISPR敲除IGFR2，EXOC1和EXOC2均能显著降低细胞表面的CI-M6PR的表达水平（图2）。

图2. CRISPRi筛选识别LYTACs的关键细胞机制
据此，作者进一步在poly(M6Pn)上共价偶联抗体，合成了第一个带正电的抗体-LYTAC分子——Ab-1（其中的抗体部分为抗小鼠IgG，相当于WB中的二抗，这样就可以配合各种一抗，降解对的蛋白底物）。首先，作者尝试了mCherry蛋白和与之对应的小鼠抗mCherry抗体，发现Ab-1能够有效地将mCherry蛋白和小鼠抗mCherry抗体一起转运到细胞内。进一步作者尝试了一个临床前研究的ApoE4抗体，发现Ab-1同样可以将其转运进细胞，以此证明了LYTAC方法应用于分泌蛋白的普遍适用性。

图3. LYTACs将可溶性蛋白质靶向溶酶体进行降解
以上实验证明，LYTAC可以靶向递送分泌的蛋白进入细胞（以外源性抗体为例）（图3），那么LYTAC是否也能如愿地降解细胞膜蛋白呢？作者进一步选用EGFR、PD-L1和CD71为例，证明了LYTAC的可行性和有效性。以临床应用的EGFR单克隆抗体cetuximab为基础，作者合成了第二个LYTAC分子——Ab-2，并发现Ab-2能够有效地降解EGFR分子，而该过程依赖于IGFR2，且能够被高浓度的M6P竞争性抑制，也可以被溶酶体抑制剂氯喹所阻断。更重要的是，通过蛋白组学检测，作者发现，Ab-2具有极强的特异性，仅降解EGFR蛋白，而不存在脱靶效应。以抗PD-L1抗体和另一个PD-L1抗体atezolizumab为基础，作者分别合成了第三个LYTAC分子——Ab-3和Atz-M6Pn，发现这两个LYTAC均能降解PD-L1分子。至此，作者证明了LYTAC技术的可行性、有效性、特异性及普适性，为靶向蛋白降解成药打开了一个全新的领域。作为一个原型，文章中的LYTAC分子还存在很多局限性，需要更多的药物学家进一步优化，使之能够成为临床上切实可行的治疗方案。

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