评价细胞内组织蛋白酶活性和溶酶体pH的新标尺学术资讯

来源：X一MOL资讯

蛋白酶在几乎所有生命活动过程中都扮演着十分关键的角色。细胞内蛋白酶的含量测定和活性评价对于理解蛋白酶的生物学功能、针对性地进行临床诊断以及蛋白酶靶向药物的开发具有重要意义。近日，厦门大学谱学分析与仪器教育部重点实验室王秋泉团队以组织蛋白酶为蛋白酶的研究模型，首次报道了基于电感耦合等离子体质谱（ICPMS）的组织蛋白酶绝对定量和活性评价分析方法。所设计制备的组织蛋白酶活性抑制探针不仅可以靶向“冻结”组织蛋白酶而且可以实现镧系元素的串联标记，继而建立了以镧系元素质谱信号强度为“标尺”的评价细胞内组织蛋白酶活性和其所处溶酶体微环境pH的新方法。

图1. 探针分子epoxysuccinyl-LYK-alkyne与组织蛋白酶活性位点Cys25巯基的共价偶联和串联点击Eu元素标记。（a）探针epoxysuccinyl-LYK-alkyne与组织蛋白酶活性结构域相互作用的理论模拟。催化结构域活性位点由Cys25和His159形成的离子对构成；氨基酸Tyr61, Tyr67, Pro68, Trp69, Val133, Val157, Ala160和 Phe207构成催化结构域的疏水性区域，探针分子中的亮氨酸（L）和酪氨酸（Y）分别通过疏水和π-π相互作用增强epoxysuccinyl-LYK-alkyne的靶向性;（b）点击反应介导的组织蛋白酶Eu元素标记，建构153Eu同位素稀释ICPMS Eu信号强度“标尺”，实现组织蛋白酶的活性评价和溶酶体微环境pH的测量。组织蛋白酶作为众多蛋白酶家族的一个典型代表，主要分布于细胞内“垃圾处理站”溶酶体中，参与溶酶体中的蛋白质降解，与细胞正常生命活动的进行和疾病的发生特别是肿瘤形成具有密不可分的联系。组织蛋白酶的各种亚型具有相似的催化结构域，第25号位半胱氨酸Cys25和其构象相邻的组氨酸His形成离子对构成活性位点。由于His的咪唑基团在溶酶体的低pH微环境中可以夺取Cys25巯基上的氢而质子化，使得Cys25的去质子化的硫与环氧基（epoxysuccinyl）的反应活性急剧提高，发生不可逆的环氧开环共价偶联；此时，弥散在细胞内的高浓度谷胱甘肽虽具有裸露的巯基却不能反应。在设计组织蛋白酶靶向探针结构时还引入了疏水性亮氨酸和具有π-π相互作用特性的酪氨酸（epoxysuccinyl-LYK）与活性域中的疏水区域相互作用，“牵引”环氧基团靠近活性位点，进一步保证了活性抑制探针的靶向性；此外，在探针的另一端修饰上炔基（epoxysuccinyl-LYK-alkyne）便于叠氮化DOTA-Eu（N3-DOTA-Eu）配合物的点击串联标记。153Eu同位素稀释ICPMS可以准确测定标记在活性抑制探针所“冻结”的组织蛋白酶上的Eu [LOD (3σ) = 25.5 fmol]，不仅实现了即时组织蛋白酶的含量测定和活性评价，而且因探针与组织蛋白酶间的反应程度受到pH值的控制，Eu的质谱信号强度又反映了溶酶体微环境的pH（图1）。随后，所发展的方法应用于肝癌细胞C7721和癌旁细胞C7701内三种组织蛋白酶cathepsin B, S和L的含量测定和活性评价，发现癌旁细胞C7701内cathepsin B, S, L的含量均显著低于肝癌细胞C7721；正相反，pH值高于肝癌细胞（图2）。这些结果暗示着组织蛋白酶有潜力作为抑制肝癌的药物靶向分子。

图2. 评价细胞内组织蛋白酶活性和溶酶体pH的Eu质谱信号强度“标尺”。（a）pH 5.5时ICPMS所测得的Eu信号强度与组织蛋白酶B，S和L酶活性之间的相关性；（b）肝癌细胞C7721和癌旁细胞C7701中组织蛋白酶B的酶活性与溶酶体微环境pH和ICPMS所测得的Eu元素信号强度之间的线性关系。所发展的评价组织蛋白酶活性和探测组织蛋白酶所处溶酶体微环境pH的“Eu-标尺”选择性和灵敏度高、不受细胞基质干扰、信号稳定准确。可以预期，只要设计合适的活性抑制探针和发展相应的元素标签，活性抑制元素标记策略这一研究思路可以拓展至其他蛋白酶的活性评价研究和应用中，而且有望成为蛋白酶的靶向药物。这一研究成果近期发表在Analytical Chemistry 上；文章的共同第一作者是厦门大学硕士研究生季彩霞和博士后梁勇。

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