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科技工作者之家 2020-08-15
来源:植物科学最前沿
CRISPR 介导的单碱基编辑(CBEs和ABEs)包括(i)由催化缺失的Cas9或Cpf1组成的DNA结合模块和(ii)工程化的胞嘧啶或腺嘌呤脱氨酶。单碱基编辑器在不造成DNA双链断裂(DSB)的情况下,能够将一个非PAM单链中DNA进行 C-T或A-G的转换。碱基编辑器已被广泛应用于纠正真核细胞和整个生物体内的点突变或诱导单核苷酸转换。催化失活的Lachnospiraceae细菌Cpf1(dLbCpf1;又称dLbCas12a)-BE是最近通过将dLbCpf1与胞嘧啶脱氨酶APOBEC1连接而形成的碱基编辑器。由D10A SpCas9 nickase和APOBEC1组成的base editor 3(BE3)识别的PAM序列为NGG,并在窗口4-8位诱导C-T转换,而dLbCpf1-BE识别TTTV-PAM序列,并在8-13位催化C-T转换。Cpf1介导的碱基编辑器拓宽了胞嘧啶脱氨酶可靶向范围。图1:dLbCpf1 BE和LbCpf1对crRNA的错配容忍度。
作者首先把HEK293T细胞中纯化的基因组DNA与含有纯化dLbCpf1 BE蛋白的RNP复合物和靶向DYRK1A的体外转录的crRNA一起培养,以诱导靶位点的C-to-U转化,然后用USER(一种用于去除尿嘧啶的大肠杆菌尿嘧啶DNA糖苷酶(UDG)和DNA糖基化酶裂解酶内切酶VIII)去除dLbCpf1 BE生成的尿嘧啶,从而导致DNA SSBs,对产生的SSB进行WGS。然后利用生物信息学分析,通过修改后的Digenome-seq确定了20个潜在的非靶点。为了检查Digenome-seq的重复性,又使用dLbCpf1 靶向BEDYRK1A独立执行了两次Digenome-seq,发现两个不同的实验捕获了相同的17个位点,包括靶位点。这些实验证明,可以用高重复性的Digenome-seq来识别dLbCpf1的脱靶位点。通过对预测的脱靶位点深测序验证,发现Digenome-seq可以识别出dLbCpf1碱基编辑频率低至0.1%的脱靶位点,说明dLbCpf1介导的Digenome-seq是一种高度灵敏的鉴定方法。然后,作者在dLbCpf1 BE的胞苷脱氨酶结构域中引入突变(在胞苷脱氨酶结构域中含有W90Y + R126E突变),发现dLbCpf1-BE-YE1显示出更高的碱基编辑特异性,比dLbCpf1 BE高出15倍。原文链接:
https://www.nature.com/articles/s41467-020-17889-9
来源:frontiersin 植物科学最前沿
原文链接:https://mp.weixin.qq.com/s?__biz=MzIyOTY2NDYyNQ==&mid=2247499241&idx=2&sn=e2ee47ce78b82d55b0225faf3c7a6976&chksm=e8bd8ff7dfca06e1a3a4a3ace4f305cbfae16bf38988c3dde4df8970e664f6c97320523386bc#rd
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