ACS Chem. Biol 基于分子逻辑门的细胞内脂质单分子成像及追踪

来源：ACS美国化学会

供稿：刘士博, 北京大学

大家好，今天为大家介绍一篇ACS Chem. Biol.的文章 “A Molecular Logic Gate Enables Single-Molecule Imaging and Tracking of Lipids in Intracellular Domains”，文章的通讯作者是来自瑞士洛桑联邦理工学院的助理教授Pablo Rivera-Fuentes。在这篇文章中，作者发展了一种荧光分子逻辑门，该荧光分子逻辑门需要光，亲脂环境和亲核试剂三者的连续输入，产生荧光信号。作者利用这一方法实现了对细胞内脂滴边界的高分辨、选择性成像，并对脂滴和内质网间运输的单分子脂质进行了追踪。

脂滴是一种广泛存在于细胞中的亚细胞结构，其主要成分包括磷脂单分子层和内含的中性脂，这一结构的功能主要包括储存能量、脂肪吞噬以及参与细胞内多种信号通路转导，因而通过成像的手段追踪细胞内脂滴的运动轨迹对深入研究其生理功能有着十分重要的意义。在已有研究中，荧光蛋白、抗体及小分子染料已被用于脂滴的标记成像，但受到传统光学显微镜分辨率的限制，这些方法均不适用于对细胞内脂滴的进行单分子标记成像。

图1. 荧光分子逻辑门用于选择性标记脂滴。

在本文中，作者发展了一种荧光分子逻辑门，其可对细胞内的脂质进行单分子成像。光诱导的重氮酮类物质发生沃尔夫重排反应时，产物的结构会因反应条件的不同而发生变化(如图1A)。作者发现，在非极性的溶剂中，光激活重氮酮类物质易形成烯酮中间体，当存在亲核试剂时，可加成得到荧光物质。而在非极性的溶剂中，光激活重氮酮类物质，产物不能产生荧光信号。两种不同的途径间的选择性是通过溶剂稳定两种不同反应中间体来控制的。基于此，作者发展了一种对脂质分子选择性成像的荧光分子逻辑门(如图1B)：即当光，亲脂环境和亲核试剂三者的连续输入，可特异性标记脂分子，产生荧光信号。

图2. 微流控液滴用于表征荧光探针对脂滴的选择性标记。

作者首先在微流体芯片产生的液滴中，考察了该探针对脂滴标记的选择性。作者利用BODIPY 493/503对微流控芯片中的脂滴进行定位。在脂滴的非极性环境内，光激活生成烯酮中间体。烯酮中间体通过自由扩散进入水相，随后水作为亲核试剂进攻烯酮中间体并生成荧光产物，因而仅在水相中观察到荧光信号(如图2.DE)。

为了特异性标记脂滴的边界，作者在化合物1(如图2A)的基础上增加了棕榈酸化修饰，得到了化合物6(如图2F)，其饱和碳链可将极性荧光产物固定在油滴上，同时带负电荷的羧酸盐官能团将染料定位在油水两相交界处，易于与亲核试剂H2O反应。实验结果表明：荧光信号在液滴的边界处显著增加，但在核心或水相中并未增加。

图3. 分子逻辑门在活细胞水平上选择性标记脂滴。 

作者接着在活细胞水平上，表征荧光探针对脂滴选择性标记的能力。作者在HeLa细胞中诱导脂滴形成。用405 nm激光照射细胞以激活探针。荧光探针与染料BODIPY 493/503的荧光信号在细胞中存在共定位。进一步对荧光信号观察可发现，BODIPY 493/503荧光信号聚集在脂滴核心位置，而荧光探针的荧光信号显著富集在脂滴外围(如图3C-D)。以上结果表明，荧光探针能够在活细胞水平中能够选择性地标记脂滴的边界。

图4. 3D-SMLM表征荧光探针对脂滴的选择性标记。 

最后，作者利用单分子定位显微技术，对细胞内的脂滴进行单分子成像。相比于传统显微镜，单分子定位显微镜具有极高的分辨率，脂滴的形态可被清晰呈现(如图4B-E)。3D-SMLM重建图片显示，荧光信号呈壳状，并具有深色核心，表明荧光探针主要标记了脂滴的边界(如图4F-I)。作者使用该探针，在活细胞水平上对追踪脂分子的移动。他们发现：在脂滴内部，脂分子存在快速移动和扩散。同时在脂滴和内质网之间也存在脂分子的交换。

总之，作者发展了一种荧光分子逻辑门，该荧光分子逻辑门需要有光，亲脂环境和亲核试剂三者的组合输入，可实现对于细胞内脂滴边界进行选择性成像。他们对其结构进行修饰，将此分子逻辑门应用到了微流控油滴模型和活细胞中，可实现脂质液滴外围的持续标记。同时，由于该探针具有出色的光物理性质，使其适用于细胞中的3D-SMLM成像以及2D单分子跟踪，并揭示了细胞内脂滴与内质网之间脂分子交换。作者认为，用于成像的分子逻辑门的概念可以扩展到其他非极性体系中，例如液液相分离形成的无膜细胞器中的单个脂分子移动轨迹。