ACS Omega：多聚糖-磷酸钙纳米颗粒增强口服疫苗的免疫应答

来源：ACS美国化学会

英文原题: Enhanced Oral Vaccine Efficacy of Polysaccharide-Coated Calcium Phosphate Nanoparticles

通讯作者：Li Li, Zhiping Xu, Australian Institute for Bioengineering and Nanotechnology, the University of Queensland, Australia.

作者：Pei Cao, Felicity Y. Han, Lisbeth Grøndahl, Zhiping Xu, and Li Li

疫苗在预防和控制人类以及动物的传染病方面中起着至关重要的作用。近年来，口服给药因其方便性，简单性和无创性进一步改善了患者的依从性，减少了副作用和交叉感染并且可以产生全身和粘膜双重免疫应答。因此，口服疫苗的研究引起了广泛关注。然而，由于在酸性胃肠道环境中抗原的降解引起的抗原不受控制的释放以及较低的粘膜通透性，与注射给药相比，口服疫苗的接种效率相对较低。近年来，纳米颗粒被逐渐应用到口服疫苗的递送来提高口服疫苗的免疫响应。

澳大利亚昆士兰大学生物工程及纳米技术研究中心许志平教授和李丽博士团队设计了核壳结构多聚糖-磷酸钙纳米复合颗粒佐剂来提高口服蛋白抗原在肠道中的递送效率，提高免疫系统的免疫应答。磷酸钙纳米颗粒具有优异的抗原负载能力，包覆海藻酸盐-壳聚糖聚合物提高抗原在胃肠道环境中稳定性，同时增强抗原透过肠粘膜的效率和提高巨噬细胞的摄取量。最终，提高系统的免疫应答。

作者首先采用微乳液方法，控制合成了20nm的抗原-磷酸钙纳米颗粒(~20nm)，通过层层自组装的方法合成了具有核壳结构的壳聚糖和海藻酸盐包覆的抗原-磷酸钙纳米颗粒(~50nm)，合成过程如如图1所示。通过调节Ca/P的比率，可以有效地控制抗原的负载量。

图1. 海藻酸-壳聚糖磷酸钙纳米颗粒的表征及蛋白抗体的负载图2. 模拟胃肠道环境中抗体从纳米颗粒中的释放曲线及释放机理

在口服疫苗的递送研究中，最重要的就是提高抗原在胃肠道中的递送效率。在模拟胃肠道环境中，壳聚糖-海藻酸盐包覆的磷酸钙纳米颗粒在强酸条件颗粒表面形成了海藻酸凝胶，保护了抗原-CaP纳米晶核，从而显著抑制了抗原的释放(图2)。当疫苗颗粒进入到肠道中pH升高(5~7)，部分海藻酸去质子化而且在颗粒表面解离。随着磷酸钙纳米颗粒的溶解，抗原缓慢从纳米颗粒中释放出来。抗原的释放可以通过控制壳聚糖与海藻酸盐的比例进行调控(图2D)。因此，在壳聚糖和海藻酸盐的双重保护系统中，大部分的抗原在递送过程中被保护并在结肠中实现持续释放。

进入肠道后，当海藻酸从CaP纳米颗粒脱落后，壳聚糖包覆的磷酸钙纳米颗粒增强了抗原的肠透过率和增强了肠上皮细胞(Caco-2)和巨噬细胞的抗原摄取，并改善了共刺激分子在巨噬细胞上的表面表达。从图3中可以看出，未包裹的CaP纳米颗粒可以显著增强巨噬细胞表面的共刺激因子CD86，CD40以及 MHC class II I-E/I-A的表达，表明了CaP纳米颗粒是一种优异的免疫佐剂。壳聚糖包裹的CaP纳米粒子进一步提高了表面共刺激因子的表达。壳聚糖靶向巨噬细胞表面上的“葡糖胺样受体”以及其表面的正电性增强了纳米粒子与细胞膜相互作用并促进细胞摄取，增强的细胞摄取能力可能导致内源性信号，从而进一步刺激免疫反应。图3. 壳聚糖-磷酸钙纳米颗粒刺激巨噬细胞表面共刺激因子的表达 

小鼠口服海藻酸-壳聚糖包覆的抗原磷酸钙纳米颗粒显著增强了粘膜IgA和血清IgG的抗体反应。图4中小鼠体内实验结果表明，海藻酸-壳聚糖包覆的抗原磷酸钙纳米颗粒显著显著提高了抗体在血清中IgG,IgG1以及IgG2a特异性免疫反应。此外，在口服免疫中，IgA抗体在胃肠道环境中可以充当一线防御屏障。图4G和4H中，增强的IgA免疫响应可能与CaP颗粒的较小的纳米尺寸，海藻酸的保护作用以及壳聚糖的黏膜穿透特性有关。基于以上发现，壳聚糖和海藻酸包裹的磷酸钙纳米颗粒可以作为口服疫苗的递送载体，通过小肠递送蛋白抗原引发免疫反应。图4. 海藻酸-壳聚糖包覆的磷酸钙纳米颗粒引起的小鼠免疫特异性免疫响应