重要突破！患者症状明显缓解，首次使用噬菌体治疗人类分枝杆菌感染

来源：BioArt

分枝杆菌感染对全球的公共卫生安全造成了严重的威胁。与此同时，由于结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis）和非结核分枝杆菌（Non-tuberculousmycobacteria, NTM）的耐药性普遍存在，给临床治疗带来了巨大的困扰【1,2】。尤其是囊性纤维化（cystic fibrosis, CF）患者经常发生包括脓肿分枝杆菌（Mycobacterium abscessus）在内的NTM感染，这些NTM具有耐药性，临床上治疗起来非常困难【3】。CF是肺移植的第三大适应证，NTM的持续性感染尤其是在手术前存在感染会导致移植后发病率和死亡率显著增高【4】。噬菌体治疗是一种可替代抗生素治疗的方法【5】。尽管个性化静脉注射噬菌体治疗其它细菌感染的案例已经被报道，但是在分枝杆菌感染治疗中还没得到应用【6-9】。

2019年5月8日，英国Great Ormond Street Hospital的Helen Spencer研究组和美国匹兹堡大学的Graham F. Hatfull研究组合作在Nature Medicine杂志上发表了一篇题为Engineered bacteriophages for treatment of a patient with a disseminated drug-resistant Mycobacterium abscessus的案例研究报告，报告中描述了一起患有CF和慢性脓肿分枝杆菌感染(一种耐药细菌)的15岁患者在进行了噬菌体治疗后症状明显缓解的案例，该案例首次使用基因工程噬菌体治疗一种广泛存在的、对抗生素有耐药性的人类分枝杆菌感染，为使用噬菌体治疗耐药细菌感染的进一步研究奠定了基础。

在该案例中一名15岁的CF患者同时伴有一系列的并发症，包括胰腺外分泌功能不足（pancreatic insufficiency）、胰岛素依赖型糖尿病（insulin-dependent diabetes）、CF相关性肝病（CF-related liver disease）、CF相关性骨质疏松症（CF-related osteoporosis）以及发育停滞等等。最终患者接受双侧肺移植手术来治疗CF。由于患者长期感染铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）和脓肿分枝杆菌（Mycobacterium abscessus），因此在接受肺移植手术之前已经接受抗NTM治疗8年。尽管肺移植之前进行了6个月的lumacaftor/ivacaftor药物治疗，但是患者的1秒用力呼气量（forced expiratory volume in 1 s, FEV1）仍降到了0.63升，同时CT扫描显示患者伴有高碳酸血症（hypercapnia）以及主肺动脉扩张（图1a）。

双侧肺移植之后，由于使用免疫抑制药物以及多种静脉注射抗生素患者产生了严重的副反应，最终只能完全依靠肠外营养同时停止静脉注射抗生素。在停止使用抗生素治疗1周，手术切口呈现红色。胸部X光检测到脓肿分枝杆菌（Mycobacterium abscessus）。患者又重新使用以前的静脉注射抗生素并加入氯法齐明（Clofazimine）和贝达喹啉（bedaquiline）。随后通过PET(positron-emission tomography)-CT扫描发现患者体内在3.5 cm× 4 cm的肝门病变处FDG（fluorodeoxyglucose）的活性以及胸骨及周围软组织病变的过程（图1b,c）。患者在肺移植手术后7个月出院并被诊断为播散性分枝杆菌感染（disseminated mycobacterial infection）。出院后，患者继续进行抗生素治疗。但8周后，患者手臂、腿部和臀部又出现了20个皮肤结节，手术伤口也出现了破损区域（图1d）。

图1 噬菌体治疗前后患者的状况

接下来研究人员通过噬菌体敏感性测试，利用实验室保存的耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis）鉴定出超过10000种的噬菌体，其中1800种噬菌体的基因序列是明确的。同时，研究人员利用在肺移植后1个月分离到的脓肿分枝杆菌亚种GD01（M. abscessus subsp. massiliense）来鉴定潜在的用于治疗的噬菌体。通过实验，研究人员鉴定出Muddy、ZoeJ和BPs三种噬菌体。第一种噬菌体Muddy能够有效的杀死GD01；第二种噬菌体是研究人员利用电穿孔DNA的噬菌体重组技术（Bacteriophage Recombineering of Electroporated DNA,BRED）构建出的ZoeJ裂解衍生物，由于精确地去除了其抑制基因从而使其有效地感染并杀死GD01；第三种噬菌体BPs和它的裂解衍生物BPsΔ33HTH感染GD01的效率较低，但是其宿主范围突变株（HRM1 and HRM10）能够有效的感染GD01（图2a）。尽管Muddy、ZoeJ和BPs在形态上相似，但是它们的基因组序列不同（图2b,c）。随后，研究人员从一个临床症状相似的病人身上分离到了另一株脓肿分枝杆菌GD02 （M. abscessus GD02），并且发现Muddy、ZoeJ和BPs三种噬菌体不能够有效地杀死其它的脓肿分枝杆菌临床分离株，这也说明三噬菌体疗法并不是一种通用的治疗方法（图2d）。尽管BPs33ΔHTH-HRM10和ZoeJΔ45在低浓度及细菌数量较多的情况下杀死GD01的效率较低，但是Muddy、BPs33ΔHTH-HRM10和ZoeJΔ45在大部分浓度下都能够杀死大多数的细胞。更重要的是，当三种噬菌体存在的情况下细菌全部杀死（图2e）。

图2 抗脓肿分枝杆菌的三噬菌体鸡尾酒

最后研究人员在进行了一次胸骨伤口局部试验后24小时，给患者静脉注射和局部注射这种经过基因改良并能够杀死特定分枝杆菌的三噬菌体鸡尾酒（three-phagecocktail）。起初，患者在治疗后第2天，出现大汗淋漓、面红耳赤等症状，但无发热及其它变化。除此之外，噬菌体治疗的耐受性良好，没有明显的副作用。经过6个月的治疗，患者的临床症状均有所改善（图1a-d）。尽管在1、3、4和5个月时，从缓慢溶解的皮肤结节拭子中培养出脓肿分枝杆菌，但是在噬菌体治疗开始后的任意时间点，均未从血清或痰中分离出脓肿分枝杆菌。噬菌体治疗开始后，研究人员通过空斑形成实验（plaque assay）以及数字PCR反应（digital polymerase chain reaction, dPCR）监测患者体内噬菌体滴度（图1e,f）。在开始治疗后1周，尽管后来的两份样本都具有溶菌活性，但血清噬菌体浓度低于阈值。随后在监测过程中发现治疗后第4天和第6天粪便中的噬菌体浓度较低，第3天和第5天伤口拭子中的噬菌体浓度较低。尽管治疗开始后第20、72、107和121天在皮肤结节拭子中仍能够分离到脓肿分枝杆菌，但其对鸡尾酒中的每种噬菌体都很敏感。研究人员推测噬菌体的耐药性可能与毒性降低有关。

综上所述，研究人员发现了一种经过基因改良的噬菌体，这种噬菌体可以消灭感染病人的特定分枝杆菌。研究人员通过给患者静脉注射三噬菌体鸡尾酒发现其并没有产生副作用。经过6个月的治疗，患者的临床症状也明显有所改善。

截止到目前，这是人们第一次使用噬菌体治疗人类分枝杆菌感染，也是第一次使用工程噬菌体的案例。尽管研究人员不能十分肯定患者的临床改善是否与噬菌体治疗直接相关，但是他们的发现极大鼓舞了人们对于使用噬菌体治疗耐药细菌感染的进一步研究。

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41591-019-0437-z 

参考文献

1. Honda, J., Virdi, R. & Chan, E. D. Front.Microbiol. 9, 2029 (2018).

2. Bloom, B. R., et al. in Major Infectious Diseases(eds Holmes, K. K., Bertozzi, S., Bloom, B. R. & Jha, P.) Ch. 11 (TeInternational Bank for Reconstruction and Development/Te World Bank, WashingtonDC, 2017).

3. Martiniano, S. L., Davidson, R. M. & Nick, J.A. Pediatr. Pulmonol. 52, S29–S36 (2017).

4. Furukawa, B. S. & Flume, P. A. Semin. Respir.Crit. Care Med. 39, 383–391 (2018).

5. Kakasis, A. & Panitsa, G. Int. J. Antimicrob.Agents 53, 16–21 (2019).

6. Sula, L., Sulova, J. & Stolcpartova, M. CzechMed. 4, 209–214 (1981).

7. Koz’min-Sokolov, B. N. & Vabilin Probl. Tuberk4, 75–79 (1975).

8. Schooley, R.T. et al. Antimicrob. Agents Chemother. 61, e00954–17 (2017).

9. Chan, B. K. et al. Evol. Med. Public Health 2018,60–66 (2018).