张毅团队证明体内DUX并非小鼠胚胎基因组激活的关键因子

来源：BioArt

原标题：专家点评Nature Genetics | 张毅团队证明体内DUX并非小鼠胚胎基因组激活的关键因子

高度分化的精子和卵子在受精之后如何转变成具有全能性（totipotency）的受精卵一直是发育生物学中尚待解决的问题。在受精之后较短的时间里，受精卵的生命活动主要依赖于卵子发育过程中积累的母源因子。随着母源因子的逐渐消耗和降解，受精卵的继续发育需要其自身基因组的激活来提供必需的相关物质。这一过程也称之为胚胎基因组激活（zygotic genome activation，ZGA）。因为胚胎基因组激活是受精卵获得全能性的必要条件之一，所以对于ZGA机制的研究一直是干细胞生物学，表观遗传学，和发育生物学等领域的热门课题。然而，哪些母源因子负责激活胚胎基因组和受精过程怎样调控母源因子去激活胚胎基因组目前尚不清楚。研究ZGA的技术瓶颈主要在于哺乳动物早期胚胎中只有极少量的细胞。而实验材料来源的限制导致很多的常见的生物学方法难以应用到涉及早期胚胎的研究中。近年来，一些能够用少量细胞来检测全基因组染色质修饰技术的建立使得人们对ZGA这一生命现象有了更深入的理解。例如，通过对胚胎基因组激活时期开放染色质区域转录因子结合特征序列的分析，张毅教授和刘江教授课题组发现了转录因子Nfya和OCT4分别在激活小鼠和人的胚胎基因组中起重要作用【1,2】。由于Nfya和OCT4只能激活一小部分胚胎基因组，这说明负责激活胚胎基因组的主要转录因子还未找到。

在小鼠的胚胎干细胞中，有少量的细胞（～1%）能够表达一些在胚胎基因组激活时期特异性表达的基因，例如MERVL和Zscan4。因为小鼠的胚胎基因组激活发生在2-细胞胚胎时期，所以这些细胞也被称之为2-cell embryo-like embryonic stem cells （2C-likecells）。2C-like 细胞和2-细胞胚胎的转录组具有一定的相似性，并且与2-细胞胚胎相比，2C-like 细胞更容易获取。目前，2C-like 细胞是最为常见的用于研究胚胎基因组激活的体外实验模型。

2017 年，通过研究2C-like 细胞，三个课题组分别报导了DUX/DUX4转录蛋白可能是激活小鼠和人胚胎基因组的关键因子【3-5】。DUX/DUX4是属于Homeobox家族的转录激活因子。DUX/DUX4在基因组上位于一段约160kb串联重复的序列中。每一个重复序列单元中都包含一个DUX/DUX4的开放阅读框。目前并没有DUX/DUX4敲除小鼠的报导，所以DUX/DUX4在正常发育过程中的功能尚不清楚。但是，DUX/DUX4在肌肉细胞中的异常激活会导致面肩胛肱型肌营养不良症（Facioscapulohumeral muscular dystrophy， FSHD）。这三篇研究论文主要发现肌肉细胞或胚胎干细胞中过表达DUX/DUX4会激活一部分只有在胚胎基因组激活时期才会表达的基因。过表达DUX/DUX4不但能够把2C-like 细胞在胚胎干细胞中的比例从1%提高到50-70%，而且敲除或敲降DUX/DUX4之后，胚胎干细胞失去了转变成2C-like 细胞的能力。这一系列的实验研究证明DUX/DUX4是在2C-like 细胞中激活ZGA基因的必要因子。然而DUX/DUX4在2-细胞胚胎中对基因组激活的功能还未被证明。

2019年5月27日，来自哈佛医学院的张毅教授、陈志远博士研究团队在Nature Genetics杂志上在线发表了题为Loss of DUX causes minor defects in zygotic genome activation and is compatible with mouse development 的文章。该团队发现，与2C-like细胞中的关键作用相反，DUX并非是小鼠2-细胞时期激活胚胎基因组的必要转录因子。

利用CRIPSR-Cas9技术，研究人员在小鼠中成功敲除了约160kb基因组片段，其中包括每个DUX拷贝的串联重复序列。与预期相反，DUX纯合敲除胚胎并没有表现出胚胎基因组激活失败的2-细胞发育阻滞表型。这些胚胎着床后的发育也基本正常，纯合小鼠出生的比例在杂合子相互交配的后代中只比预期少了约25%。由于这些纯合敲除小鼠父母本都是杂合子，而其中一个DUX拷贝Gm4981是母源因子（Gm4981与其它拷贝相比在5‘端缺失其中一个DNA结合域），这些小鼠胚胎能够存活有可能是由于母源的Gm4981补偿效应。为了验证这一假设，研究人员接下来测试了DUX纯合敲除小鼠的繁殖能力。即使没有母源Gm4981和其它DUX拷贝，胚胎也没有表现出2-细胞发育阻滞，而是能够发育到成年。但是DUX纯合敲除小鼠相互交配发育到成年小鼠约是对照的一半，说明DUX缺失对胚胎发育有一定的影响。这一发现与最近Didier Trono课题组发表在bioRxiv上的结果相似。

为了确认DUX在胚胎基因组激活中的非必要性，研究人员分析了DUX/Gm4981 缺失的小鼠1-细胞和2-细胞胚胎的转录组。1-细胞时期的转录组在DUX/Gm4981敲除胚胎和对照之间几乎没有差别。而在2-细胞时期，与对照相比，DUX/Gm4981敲除胚胎有少量的基因和重复序列表达水平下调。通过分析2906个在2-细胞时期激活的胚胎组基因，只有小部分（17%）在DUX/Gm4981敲除胚胎中下调超过2倍。值得注意的是，除了一小部分基因外（12.5%），绝大部分之前报导的外源DUX在2C-like细胞中的目标基因在DUX/Gm4981敲除的2-细胞胚胎中都表达正常。这一系列结果说明，DUX在小鼠胚胎基因组激活中并不起关键作用，并且它在小鼠胚胎发育过程中也不是必要的。

总之，本文通过分析DUX敲除小鼠证明了 DUX对于胚胎基因组激活并不是必要的。此结论与以前发表的DUX在2C-like细胞中的关键作用形成了较大反差。这说明尽管2C-like细胞在一些ZGA基因的表达上和2-细胞胚胎相似，但 2C-like细胞和2-细胞胚胎原则上是两个不同的实验模型。这一研究结果说明： 1）通过分析2C-like细胞得到的胚胎基因组激活结论仍需要在小鼠胚胎中进一步验证；2）关键的负责2-细胞基因组激活的转录因子仍“在逃”。                                                                            

专家点评

汪阳明（北京大学分子医学研究所研究员）

当读完张毅老师的这篇Nature Genetics 和3月份BioRxiv瑞士的Trono实验室发表的文章（我得承认一个多月前先读的BioRxiv）时，我陷入了一种既失落又欣喜的复杂情绪。2017年多篇Dux控制ZGA（受精卵基因组激活）程序的文章发表的时候，我也是这样一种状态，欣喜的是ZGA终于有了一个核心转录因子，失落的是为什么做出这么好的发现的不是我们。转到今天，我的失落又变成了原来Dux也不是那个传说中的核心转录因子，而我的欣喜则是我们还有很多人仍有机会去找到那个更重要的ZGA激活的开关转录因子。细想起来，Dux从神坛落地或许并不是什么不可预期的黑天鹅事件，两年前的文章毕竟大多用的是细胞模型，只有Trono实验室直接在胚胎中做了敲除试验，但也只是体外培养的受精卵。可是要回答生命中第一波最重要的转录事件究竟是谁控制的，最终还是要真刀真枪地在动物模型中去做，不是吗？这两篇文章用敲除小鼠模型（同样的背景B6D2F1）不约而同地对曾经预想的Dux的重要作用说了No，尽管具体的表型稍微有些不同，Trono实验室在Dux-/- X Dux-/-的实验中得到了更少的产仔数，并且出现了部分新生小鼠被母鼠吞噬的“鼠伦”悲剧，但毕竟在Dux完全不存在的情形下，有诸多小鼠胚胎顺利激活了受精卵基因组，更有一些小鼠个体成功活了下来。有人或许感到疑惑，一个基因（其实不是一个，是一串，因为Dux有多个重复并排在大约160kb的区域）的敲除，没有什么大不了的表型，为什么还能发在一个相当decent的杂志上呢? 有人会说，你看最后一个作者不就知道了，是大牛啊。我知道张毅老师当然是大牛，不过我不这么看这个问题，我想的是两年前的文章给了这个领域一个未经证实的幻想，而今年的这两篇文章针对一个重要的问题戳破了那个泡泡，正了视听，让很多人对找到那个终极激活因子重新燃起了斗志和希望。可是问题来了，控制受精卵基因激活就必须有一个核心转录因子吗？生命的起始如果只依赖于命悬一线是不是太草率了？或许有许许多多的冗余因子一起控制着这个过程，毕竟生不出仔来，一个物种再强大，也都到头了。感谢这两个严谨工作的以正视听，让我们明白，在受精卵基因组激活研究领域，“革命尚未成功，同志仍需努力”，还让我们明白，in vitro尽管容易做一些，但要下定论，in vivo是必须的。

原文链接：

https://doi.org/10.1038/s41588-019-0418-7

参考文献

1. Lu, F. et al.Establishing Chromatin Regulatory Landscape during Mouse PreimplantationDevelopment. Cell 165, 1375-1388, doi:10.1016/j.cell.2016.05.050 (2016).

2. Gao, L. et al. Chromatin AccessibilityLandscape in Human Early Embryos and Its Association with Evolution. Cell 173,248-259 e215, doi:10.1016/j.cell.2018.02.028 (2018).

3. De Iaco, A. et al. DUX-familytranscription factors regulate zygotic genome activation in placental mammals. Nature genetics 49, 941-945, doi:10.1038/ng.3858 (2017).

4. Hendrickson, P. G. et al. Conservedroles of mouse DUX and human DUX4 in activating cleavage-stage genes andMERVL/HERVL retrotransposons. Nature genetics 49, 925-934, doi:10.1038/ng.3844(2017).

5. Whiddon, J. L., Langford, A. T., Wong,C. J., Zhong, J. W. & Tapscott, S. J. Conservation and innovation in theDUX4-family gene network. Nature genetics 49, 935-940, doi:10.1038/ng.3846(2017).