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科技工作者之家 2019-06-03
来源:iNature
RNA-Seq是研究人类遗传学和疾病相关病理学的宝贵工具,例如,转录异构体的表达和用途是包括癌症在内的诸多疾病中健康组织和患病组织之间变异的重要来源。RNA-Seq也有助于识别不断增加的病症中出现的融合转录本。
RNA-Seq分析面临的挑战
随着测序技术的不断进步,我们能够对转录组开展更为深入的测序工作,但目前最常用的RNA-seq策略是利用poly(dT)引物或随机六聚体引物进行cDNA合成。之后再通过PCR来扩增这些cDNA链,不过这可能会降低cDNA文库的复杂性,影响cDNA的相对丰度,并造成某些种类的RNA丢失。此外,在PCR扩增过程中,RNA的所有修饰都会丢失。因此RNA-Seq技术仍然有一些重要的局限性有待解决,如:
1. 准确组装完整的转录本
2. 准确识别并量化各基因的多个同源异构体
3. 无偏倚全长转录本及碱基修饰分析
最近的一些研究表明,来自牛津的Oxford NanoporeTechnologies的新一代纳米孔长读长测序技术能够灵活的应对RNA-Seq所面临的这些挑战。纳米孔测序能够直接进行RNA测序,使其可以克服所有的上述挑战 - 提供无偏倚、全长、链特异性的RNA序列(图1):
图1包含扩增的测序工作流程易受序列特异性偏倚的影响。使用三种纳米孔测序技术(PCR-cDNA,直接cDNA和直接RNA)和典型的短读长cDNA技术构建酵母转录组文库。a)在所有情况下,纳米孔数据集里的GC偏倚低于短读长数据集。b)与短读长测序数据相比,在所有方法中纳米孔测序数据的长度偏倚较小。
来自日本东京大学的Suzuki 等人采用纳米孔cDNA测序法对与肺癌有关的一组基因中(EGFR, KRAS,NRAS, NF1, ALK 和RET )的多种常见突变类型,包括单个碱基替换、短片段缺失、外显子跳跃和融合进行了测序。此外,该团队利用纳米孔测序获得的长读长对两个抗癌药物疗效相关的基因组DNA突变进行了定相。在研究取得成功之后,研究人员评论说到:“简单的纳米孔测序的方法使中小规模的研究中心和医院可能通过驱动基因的分型来开展研究,并选择合适的治疗方法”。
意大利巴里大学的研究人员利用纳米孔测序检测BCR-ABL1激酶结构域(KD)突变的潜力。BCR-ABL1基因融合发生在95%的慢性粒细胞白血病患者中,该基因编码非调节酪氨酸激酶蛋白。BCR-ABL1基因中的KD突变引起并表明其对一线治疗药物酪氨酸激酶抑制剂产生了抗药性。
在一项涉及24个样本的BCR-ABL1变体检测研究中,使用100x和1000x测序深度,研究小组评估了纳米孔测序在鉴定大小为1.7 kb的cDNA扩增子中的KD突变的能力。在2个样本中,纳米孔测序数据鉴定出了具有临床意义的突变,而使用Sanger测序结果最初并不明显(图2)。该团队还指出,使用低于100x的纳米孔测序深度足以识别所有突变。通过纳米孔测序技术获得的长读长更能检测到在同一克隆中的突变 (in cis;复合突变体),而这对于Sanger测序或短读长测序极具挑战。
图2纳米孔测序(左侧)在2个样本中检测到了起初在Sanger测序数据(右侧)中并不明显的突变,这表明纳米孔技术增强了灵敏度。图片由意大利巴里大学CrescenzioMinervini博士提供。
纳米孔测序技术的特点是单分子测序,测序读长长(超过2Mb),测序速度快,测序数据实时监控,机器方便携带等。根据不同项目及应用,该公司目前有三款产品(MinION, GridION, PromethION)可供选择。
图3 Oxford Nanopore公司的RNA测序仪的应用领域概述
参考文献:
[1] Beyer, K.等人- “路易体疾病中α-突触核蛋白、parkin和synphilin-1异构体的差异表达”-《神经遗传学杂志》9, 163-172(2008)。
[2] Gonzalez, E.和McGraw,T.E - “Akt激酶:代谢和癌症中的异构体特异性”-《细胞周期杂志》8,2502-2508(2009)。
[3] Minervini, C.F.等人基于纳米孔MinION技术的深度测序在BCR-ABL1阳性白血病中的突变分析,《手术病理学》,103(1):33-37(2017)
[4] Suzuki,A.等人使用长读长便携式测序仪对肺癌中的癌症突变进行测序和定相,《DNA研究》,24(6): 585-596 (2017)
[5] Moore, F.R.., Rempfer, C.B.和Press,R.D. BCR-ABL1定量聚合酶链反应(RQ-PCR) 融合基因转录物监测慢性粒细胞白血病,《方法分子生物学》,999:1-23 (2013)。
来源:Plant_ihuman iNature
原文链接:http://mp.weixin.qq.com/s?__biz=MzU3MTE3MjUyOA==&mid=2247501713&idx=1&sn=cd046c0dd04b6626b4356f5dee7659be&chksm=fce6b44ecb913d5846a7148ec0a394d2725553b2f18f4db76cf6dbdb60635eba941d44c3b1df&scene=27#wechat_redirect
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